Secuenciación del DNA. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

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1. Explique brevemente los protocolos clásicos de secuenciación, las etapas en común que presentan y cuales son sus principales diferencias.

Podemos hablar de dos protocolos clásicos de secuenciación, el método enzimático o de Sanger, y el método químico o de Maxam y Gilbert, antes de especificar el protocolo, hay que tener en cuenta que ambos se basan en la generación de una población de moléculas marcadas radiactivamente.compartiendo la etapa de marcado y separación. Se pueden diferenciar en la aplicación de estos, enzimático fragmentos corto de ADN, químico fragmentos largos de ADN, la duración, las reacciones de secuenciación del método enzimático se pueden realizar en unas horas, en cambio las del método de Maxam-Gilbert tardan al menos un día, además de que las reacciones del método de Sanger son más “puras”, con menos contaminantes (Márquez et al,2014).

El método de Maxam–Gilbert se basa en la rotura química de DNA de cadena sencilla (ssDNA) cuyo extremo 5’ se marca radiactivamente. La muestra se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas, las roturas se realizan de forma controlada y específica, rompiendo la cadena nucleotídica de cuatro formas diferentes: en C; en C o T; en G; y finalmente en G o A, para que se genere una población de fragmentos con todas las posibles combinaciones y longitudes, posteriormente se pueden agrupar por tamaño mediante electroforesis en gel. Para visualizar los fragmentos generados en cada reacción, se hace una autorradiografía del mismo, lo que proporciona una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo, a partir de las cuales se puede inferir la secuencia. (Dorado, sf.; Márquez et al, 2014.).

El procedimiento de Sanger se basa en la polimerización del ADN, emplea un cebador marcado radiactivamente, una DNA polimerasa, que copia la cadena molde en presencia de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y una pequeña cantidad de un didesoxinucleósido trifosfato (ddNTP), conocido como terminadores, esto se lleva a cabo en cuatro reacciones paralelas distintas. El cebador  se une a la hebra molde favoreciendo su reconocimiento por la ADN polimerasa y el inicio de la síntesis de la nueva hebra, en donde la ADN polimerasa va añadiendo dNTPs hasta que de forma aleatoria, incorpora el ddNTP, éste carece de extremo 3’–OH, incapaz de unirle el siguiente nucleótido y se interrumpe la síntesis, cada uno de los tubos contiene un ddNTP distinto. En el tubo van a aparecer fragmentos secuenciados de diferentes tamaños e interrumpidos por un ddNTP, siendo diferente en cada tubo. A continuación, el contenido de cada uno de los tubos se corre en carreras diferentes de un gel de acrilamida (Dorado, sf.).

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