COMPARACION DE LA MIELINIZACION DEL CEREBRO

Comparamos la mielinización del cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal en los fetos de cerdos más grandes y más pequeños dentro de una camada durante la gestación tardía. Los Gilts fueron sacrificados en los días 92, 100 y 110 de gestación y estos tejidos neuronales se obtuvieron de los fetos más grandes y más pequeños de cada camada. El ARNm de proteína básica de mielina (MBP) se cuantificó en cada tejido usando reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa en tiempo real (rtPCR). Se recuperó mielina de cada tejido y se usó electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y cromatografía en capa fina (TLC) para medir MBP y lípidos, respectivamente. MBP mRNA aumentó con el avance de la gestación en los tres tejidos examinados

 (P ≤ 0.05) y fue menor en el tronco encefálico de los lechones pequeños comparado con los lechones grandes (P <0.01). Se observaron dos bandas de proteína teñidas con coomassie (HMBP y LMBP) mediante SDS-PAGE. Se obtuvieron seis bandas de lípidos prominentes por TLC (colesterol, hidroxi (h) -cebroside, nonhidroxi (nh) -cebroside, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y esfingomielina). Interacciones significativas día por el tamaño fetal para MBP y lípidos cerebelosos indicaron que la mielinización cerebelosa en los fetos más pequeños fue menor en comparación con los fetos más grandes en los días 100 y 110 de la gestación. La MBP y el lípido de mielina obtenidos del tallo cerebral aumentaron con el avance de la gestación y los LMBP y los lípidos fueron menos en lechones pequeños comparados con los lechones grandes. Por el contrario, la mielina en la médula espinal aumentó con el día de la gestación, pero no fue diferente entre los fetos más pequeños y los más grandes. Estos resultados confirman que la mielinización del cerebelo y el tronco encefálico, pero no la médula espinal, se reduce en fetos pequeños durante la gestación tardía.

1. Introducción

La mortalidad antes del destete de los lechones oscila entre 10 y 20% (Bereskin et al., 1973, Fahmy et al., 1978) y parece estar aumentando a medida que la selección de la industria para aumentar el tamaño de la camada se hace más exitosa. Los estudios han identificado el pequeño peso al nacer como un rasgo primario asociado con la mortalidad antes del destete (Pomeroy, 1960, Tuchscherer et al., 2000, Milligan et al., 2002), pero los déficits fisiológicos específicos en los lechones de bajo peso al nacer que son responsables de su mayor Mortalidad no son claras. Un posible déficit es la mielinización cerebral, que se ha informado que está deteriorada en lechones de bajo peso al nacer en comparación con los lechones normales de peso al nacer (Dickerson et al., 1971). Sin embargo, estos investigadores midieron el colesterol cerebral y los cambios inferidos en la mielinización cerebral a partir de estas mediciones. Mientras que el colesterol es un componente de las membranas de mielina, es también un componente de todas las membranas plasmáticas de células cerebrales y, por lo tanto, no es específico para la mielinización. Buscamos reexaminar esta pregunta utilizando métodos que eran específicos de la mielina.

Se sabe que la mielinización de los axones de las células nerviosas afecta la velocidad de transmisión de los impulsos nerviosos y, por lo tanto, se sugiere que afecta a la coordinación del movimiento ya la velocidad de las acciones reflexivas (Fields, 2008). El mayor peligro en el medio ambiente del lechón recién nacido es la presa, ya que se ha reportado que una gran proporción de la mortalidad antes del destete se debe al aplastamiento por la presa (Lay et al., 2002). Si ocurre, el deterioro de la coordinación y los reflejos debidos a la reducción de la mielinización podrían disminuir la capacidad del lechón para evitar la presa cuando sea necesario y, por lo tanto, pueden contribuir al riesgo de aplastamiento. Los informes anteriores que tratan de la mielinización en lechones midieron todo el cerebro (Dickerson et al., 1971, Pond et al., 2000), pero se sabe que regiones cerebrales específicas están implicadas en la coordinación del movimiento (cerebelo, Glickstein y Doron, 2008) y Reflejos (tallo cerebral y médula espinal, Poppele y Bosco, 2003). Por lo tanto, la medición de las diferencias de mielinización que pueden ser más relevantes para la supervivencia antes del destete es probable que se obtengan midiendo la mielinización en estas regiones específicas del sistema nervioso central.

El objetivo de este estudio fue comparar la mielinización de regiones específicas del sistema nervioso central involucradas en la coordinación de movimientos y reflejos entre los fetos de cerdos más grandes y más pequeños durante la gestación tardía. Los fetos más grandes y más pequeños fueron examinados para comparar el mejor cerdito (presumiblemente el más grande) con el cerdito más comprometido (presumiblemente el más pequeño) dentro de cada camada. Para asegurar que la mielina se midió específicamente, se usó una técnica de centrifugación para aislar la mielina de regiones específicas del cerebro. Para medir la mielina, tanto la proteína básica de mielina (MBP) como las fracciones lipídicas de mielina se midieron usando electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) y cromatografía en capa fina (TLC), respectivamente.

2. Materiales y métodos

El uso de animales en este experimento fue de acuerdo con las directrices del USDA para el uso del ganado en la investigación. Se observaron doce cerdas (~250 días de edad) para el estro y apareamiento en estro permanente. Las cerdas preñadas fueron sacrificadas en el matadero de USMARC a los 92, 100 o 110 días de gestación (n = 4 cada día) y los tractos reproductivos fueron recuperados. El útero se abrió a lo largo de la superficie antimesometrial y se pesó cada feto vivo. El feto más grande y más pequeño en peso, independientemente del sexo, fue identificado y aproximadamente la mitad del cerebelo, tronco cerebral y una porción de 2-4 cm de la médula espinal justo antes de la cadera fueron recolectados, pesados ​​y homogeneizados en 10 volúmenes Suponiendo 1 g = 1 ml) de Tris 10 mM, sacarosa 1 M (Horrocks, 1967). La otra mitad del cerebelo y el tronco encefálico y otra porción de 2-4 cm de la médula espinal se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido para medir el ARNm de MBP mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real (rtPCR).

El ARN total de cerebelo, tronco cerebral y médula espinal se extrajo utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valenica, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Para la eliminación del ADN genómico, el tratamiento con DNasa-I se realizó en la columna de espín usando ADNasa proporcionada por el fabricante (Qiagen). La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). No hubo diferencias entre las muestras en la calidad y la integridad del ARN basado en la relación de absorbancia a 260 y 280 nm (~ 2,0) y la visualización de bandas de ARNr 28S y 18S en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio (datos no mostrados) .

Los cebadores específicos para el porcino se diseñaron usando el software Primer3 (Rozen y Skaletsky, 2000) para amplificar el ARNm específico para MBP (Adyuvante directo: 5-CCCAGGATGAAAACCC TGTA-3, Iniciador inverso: 5TCCCAGCTTGAAGATTTTGG-3. (GAPDH), actina (ACTB), proteína de activación de la tirosina 3monooxigenasa / triptófano 5-monooxigenasa, gamma (YWHAG), proteína ribosómica, P2 grande (RPLP2 ) Y 18S ribosomal rRNA (18S) se utilizaron como transcripciones de control de referencia interna.Se utilizó un método de PCR en dos etapas en tiempo real para el análisis de expresión de transcripción como se describió anteriormente (Miles et al., 2009) La expresión de MBP se determinó como (Vandesompele et al., 2002) Este software calcula una medida de estabilidad de expresión génica (M) para cada transcripción de referencia y clasifica el orden de aumento de la expresión stabi Lidad. Los transcritos de referencia más estables en el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal fueron GAPDH, ACTB y YWHAG (valores de M en cerebelo: 0,465, 0,551 y 0,482, tronco cerebral: 0,358, 0,348, 0,458, médula espinal 0,275, 0,334 , 0,370, para GAPDH, ACTB, y YWHAG, respectivamente). Al mismo tiempo, el algoritmo GeNorm calcula un NF para cada observación experimental basada en la mayor Transcripciones de referencia estables. El NF se utiliza para calcular la calidad relativa de la expresión de MBP basada en una relación de la expresión de MBP (2-Ct) a NF (Vandesompele et al., 2002).

Se usaron alícuotas (0,5 ml) de los homogeneizados tisulares para preparar mielina por centrifugación (13.000 xg). El sobrenadante se recogió, se diluyó 10 veces con Tris 10 mM, pH 8,0, y se centrifugó para recoger la mielina.

Debido a su baja densidad, la mielina se separa de las membranas plasmáticas en sacarosa 1 M (Horrocks, 1967) y luego se puede sedimentar por dilución de sacarosa. La especificidad de este procedimiento se ensayó comparando el sedimento resultante de homogenados de tronco encefálico versus homogeneizados de hígado. Los homogeneizados de tronco encefálico dieron como resultado la recuperación de un granulado mientras que los homogeneizados de hígado dieron como resultado una no recuperación (datos no mostrados).

La mielina aglomerada se sometió luego a SDS-PAGE (Buhi et al., 1989) disolviendo el sedimento en 1 ml de tampón de carga SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol y electroforesis de 50 l de cada muestra en un gel de acrilamida al 12,5%. Los geles se tiñeron usando coomassie (Roberts et al., 1984), se formaron imágenes, y las bandas correspondientes a MBP se midieron usando densitometría (2D Advanced, Nonlinear Dynamics Inc., Durham, NC). Para densitometría, cada banda fue rodeada y la densidad media del borde de cada banda se restó como fondo. No se realizó normalización de los datos de densitometría. La identificación de las bandas como proteína básica de mielina se confirmó usando inmunotransferencia con antisuero de MBP antihumano con y sin péptido bloqueante (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), seguido de IgG anti-conejo ligado a peroxidasa de rábano como el segundo anticuerpo. Nova Red (Vector Labs, Burlingame, CA) como detector de acuerdo con las instrucciones del kit para inmunotransferencia.

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