Cinetica enzimatica TALLER CINETICA ENZIMÁTICA

TALLER CINETICA ENZIMÁTICA

1. Para una enzima (5 μM) se reportaron las siguientes velocidades iniciales, según la concentración del sustrato:

[pic 1][pic 2]

1. Dibuje la gráfica de Michaelis-Menten para esta enzima.

[pic 3]

1. Dibuje la gráfica de Lineweaver-Burke para esta enzima.

[pic 4]

1. Determine la KM y la Vmax

1. Para la gráfica de Michaelis-Menten

Es imposible obtener un valor exacto a partir de una representación de Michaelis-Menten. Como la Km es la concentración de sustrato a la que la velocidad es semimáxima (Vmax/2), también resulta imposible determinar con precisión el valor de Km.

1. Para la gráfica de Lineweaver-Burke[pic 5]

 [pic 6]

[pic 7]

[pic 8]

 [pic 9]

[pic 10]

[pic 12][pic 11]

[pic 13]

[pic 14]

[pic 16][pic 15]

[pic 17]

[pic 18]

 [pic 19]

[pic 20]

[pic 21]

[pic 22]

1. Indique en ambas gráficas (a & b), dónde se reconocen la Vmax y KM.

1. Gráfica de Michaelis-Menten

[pic 23]

1. Gráfica de Lineweaver-Burke

[pic 24]

1. Calcule la constante catalítica y la eficiencia catalítica de esta enzima.[pic 25]

[pic 26]

[pic 27]

   [pic 28]

[pic 29]

[pic 30]

[pic 31]

2- Usted está tratando de reproducir los resultados experimentales que obtuvo un estudiante que trabajó en su laboratorio. Él ha reportado que la enzima de interés tiene una kcat de 1875 s-1 y una eficiencia catalítica de 7.5x107 M-1 s-1.

1. ¿Cuál es la KM de esta enzima?

1. En la repetición de las mediciones, usted quiere obtener una Vmax de 10 mM s-1. ¿Cuánta enzima debe usar?, dé el resultado en μM.

1. Calcule a qué concentraciones de sustrato en μM usted debe medir la tasa inicial V0 para obtener los siguientes valores:

[pic 32]

1. Kcat = 1875 s-1                    Eficiencia = 7.5×107 M-1 S-1

[pic 33]

           [pic 34][pic 35]

  =  2.5×10-5 M[pic 36]

1. Kcat =            [pic 39][pic 37][pic 38]

   = 5.33×10-3 mM[pic 40]

5.33×10-3 mM =  5.33μM[pic 41]

1. V0 = Vmáx [pic 42]

V0 (Km +[S]) = Vmáx * [S]

V0 * Km + V0 * [S] = Vmáx * [S]

V0 * Km = Vmáx * [S] - V0 * [S]

[S] = [pic 43]

[S] = [pic 44]

1. a) [S] = 8.33×10-3mM  8.33 μM[pic 45]

1. b) [S] = [pic 46]

[S] = [pic 47]

S] = 0.02045mM  20.45 μM[pic 48]

1. c) [S] = [pic 49]

[S] = [pic 50]

S] = 0.0375mM  37.5 μM[pic 51]

1. d) [S] = [pic 52]

[S] = [pic 53]

S] = 0.225mM  225 μM[pic 54]

1. Cree una gráfica predictiva de Michaelis-Menten para su enzima.

[pic 55]

1. Cree una gráfica predictiva de Lineweaver-Burke para su enzima.

[pic 56]

3- En la tabla se presenta la hidrólisis de lactosa por la actividad de la β-galoctosidasa. Grafique los siguientes datos para las funciones v = f(s), 1/v =f (1/s) y s/v=f(s) y determine de las gráficas los valores de Vmax y Km según la tabla y compare los valores obtenidos.

[pic 57]

[pic 58]

[pic 59]

[pic 60]

Cálculos de KM y Vmáx

F(x)= mx+b                                 m=[pic 61]

F(X)= 1/Vo                    

M= KM/Vmáx                              m=[pic 62]

B= 1/Vmáx                                  m=0.0344

1/Vo-mx=b                                  

(3.57143) -(0.0344 x 100)=b      

B=0.13143                                  

Vmáx= 1/b

Vmáx= 1/0.13143

Vmáx= 7.61

KM= mVmáx

KM= (0.0349)(7.61)

KM= 0.262 

Conclusión:

Se puede decir que el proceso de linealización, específicamente la gráfica de Lineweaver-Burk presenta ciertos márgenes de error, debido a que obtuvimos datos experimentales y si seleccionamos datos aleatorios para formar la pendiente, no dará igual, da muy cercana, pero no la misma. Asimismo, es más fácil determinar el KM en una gráfica de Michaelis Menten, pues esta es igual a ½ de la velocidad máxima, siendo esta última donde encuentra una especie de equilibrio. Aunque, por facilidad, es más fácil interpretar valores linealizados que valores en forma de parábola con asíntotas.

4- En los siguientes gráficos se muestra la cinética de una de la actividad de una enzima “A” y luego la enzima inhibida por la acción de una molécula “B” (fig.n1). En el figura 2 se muestran ambas curvas linealizadas, por el método de los inversos o de Lineweber-Burk.

1. Al observar la gráfica determine qué tipo de inhibidor es la molécula “B” para la enzima “A”

De acuerdo a la gráfica el tipo de inhibidor que se observa, es un inhibidor No-Competitivo.

Se dice que es este tipo de inhibidor, debido a que, Vmáx disminuye y Km queda igual.

1. Determine los parámetros inherentes (Km y Vmax) en la figura 1 para la enzima “A” y determine Km y Vmax según la curva linealizada y compare.

Figura #1 (Sin inhibidor)

Vmáx ≈ 16.  y  Km ≈ 2.

Figura #1 (inhibidor)

Vmáx ≈ 8.  y   Km ≈ 2.

Los datos para esta figura nos son exactos claramente porque en la gráfica no están representados con exactitud. Queda a la observación de cada persona.

Figura # 2 (sin inhibidor)

Y= 0,2653x + 0.0331            m = 0.2653

        b = 0.0331

Vmáx =          Km= m × Vmáx[pic 63]

Vmáx =  = 30.21mMs-1        Km= (0.2653 * 30.21)[pic 64]

        Km= 8.015mM

Figura #2 (Con inhibidor)

Y= mx+b

Y= 0.3395x + 0.0799               m = 0.3395

        b = 0.079

Vmáx =          Km= m × Vmáx[pic 65]

Vmáx =  = 12.66mMs-1        Km= (0.3395 * 12.66)[pic 66]

                                                   Km= 4.30mM

• En la figura #1 Se puede observar que la Vmáx se ve afectada cuando hay un inhibidor, sin embargo, la concentración de soluto no se ve afectada en lo más mínimo. Esto se puede lograr con un inhibidor incompetitivo o No-competitivo. Este inhibidor tiene la capacidad de unirse a la enzima en un sitio diferente al centro activo, ya sea, en la enzima (EI) o en la enzima sustrato (ESI). Por lo que su Km que es la concentración de afinidad no se ve afectada.
• Para una mayor exactitud, la figura #1 se linealiza, convirtiéndose en la figura #2. La gráfica está representada por líneas rectas semi-paralelas que no se intersectan en ningún punto.

5)[pic 67]

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