Cuantificación Espectrofotométrica De Aminoácidos Y Proteínas

INTRODUCCIÓN

Las sustancias pueden absorber energía radiante, la absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas, depende de la estructura de las moléculas, además es una característica para cada sustancia química (1). La absorción de la luz, en este campo de longitudes de onda, da lugar al salto de electrones desde un nivel de energía a otro entre los niveles de mayor energía, o más externos, de los átomos y de las moléculas. Los compuestos orgánicos que poseen dobles enlaces conjugados o anillos aromáticos, los iones de los metales de transición, especialmente los iones complejos formados con reactivos orgánicos, son compuestos químicos que absorben en la región ultravioleta-visible y se pueden determinar cuantitativamente midiendo la absorción o absorbancia (3).La fenilalanina, la tirosina y el triptófano absorben la luz UV, aunque la fenilalanina en menor grado. Lo que explica las características de absorbancia fuerte de luz por parte de las proteínas a una longitud de onda de 280 nm. (1)

OBJETIVOS

 Conocer la cuantificación de sustancias mediante la Ley de Lambert-Beer

 Comprender la capacidad de absorbancia de longitudes de onda de los aminoácidos glicina y triptófano y la proteína seroalbúmina de bovino SAB.

 Conocer e integrar conocimientos sobre la espectrofotometría.

 Reconocer y cuantificar los aminoácidos y proteínas en solución.

 Leer la absorbancia de los aminoácidos glicina, triptófano y la proteína seroalbúmina de bovino a 280 nm.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Se utilizaron cuatro tubos de ensayo para incorporar 3 mL de solución de NaCl 0,9% p/v, Glicina, Triptófano y la proteína Seroalbúmina de bovino (SAB) por separado en cada uno de los tubos. Con el espectrofotómetro preparado para utilizar, se incorpora la solución de NaCl 0,9% p/v en una cubeta de cuarzo la cual fue la primera en poner en el espectrofotómetro y se reguló su absorbancia en 0,000, determinando el valor obtenido como un 100%, sin retirar la cubeta de cuarzo con esta solución, se procedió luego con cada uno de los tubos restantes a repetir el procedimiento para medir la absorbancia de cada una de las muestras. Con esto se determinaron las concentraciones en mg/ml de cada una, utilizando los coeficientes de extinción molar de cada especie a 280 nm y la Ley de Lambert-Beer.

RESULTADOS

En base al experimento práctico, los datos que arrojó el espectrofotómetro muestran que la absorbancia de la glicina es de 0,016, el triptófano de 0,680 y la SAB de 0,711.

Los cálculos matemáticos se basaron en la ecuación simplificada de la ley Lambert-Beer

(DO = Ecl), donde el valor incognito corresponde a la concentración, por tanto se realiza el despeje de la fórmula resultando en c = DO . Arrojando los siguientes resultados:

E

• La concentración de la Seroalbúmina de bovino es 1,62 × 10 - 5 M y 1,077 mg/mL.

• La concentración del Triptófano es 1,20 × 10 - 4 M y 1 mg/mL.

DISCUSIÓN

La relación entre la absorción de luz por la solución diluida o por un gas y concentración de la fase absorbente, viene dada por la ley de Beer. La relación entre la absorción de la luz y el camino recorrido por ésta, viene dada por la ley Lambert. Para fines óptimos es conveniente considerar ambas leyes conjuntamente. Mientras mayor sea el coeficiente de extinción, bajo una condición particular, mayor será la cantidad de luz UV absorbida (2). Así, el hacer incidir un fotón de radiación electromagnética con energía apropiada sobre una molécula con un determinado nivel energético, está aumentó su contenido energético absorbiendo el fotón, pasando a un estado excitado. Utilizando la absorbancia a 280 nm, la glicina 0,025 mg/mL arroja un resultado de 0,016 de una Densidad Óptima (DO) o, Absorbancia de la sustancia, siendo esta la cifra más baja de las tres absorbancias medidas, la cual corresponde a un aminoácido que presenta una absorbancia despreciable, puesto que no se encuentra dentro del rango lineal, los cuales abarcan de 0,050 a 1,000, por lo tanto la absorbancia que presentó la glicina sale del rango y la convierte en una absorbancia despreciable y la razón de esto es que este aminoácido, no presenta anillos aromáticos en su estructura los cuales son los responsables de la absorbancia de la luz UV (1). La solución de triptófano, arroja el resultado de una absorbancia de 0,680, puesto que el triptófano es un aminoácido aromático, el cual contiene dos anillos de este tipo y tiene la capacidad de absorción de luz UV. Éste aminoácido debería tener absorbancia significante debido a los dos anillos aromáticos que posee en su estructura (2). En cuanto a la absorbancia de la SAB arroja un resultado de 0,711, esta corresponde a una proteína formada por 582 aminoácidos, el cual contiene bajas cantidades de triptófano, la absorbancia obtenida tiene relación con la concentración y volumen de la solución, utilizando de las soluciones de triptófano 0,025 mg/mL y SAB 1 mg/mL. Por lo tanto, se logra inferir, que la SAB presenta una mayor absorbancia ya que está en mayor concentración la solución y al tener esta proteína la cual presenta triptófano en su estructura. Gracias a la utilización de la Ley de Lambert-Beer y la correcta aplicación de la formula, se logra determinar

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