CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS  (1)

Fernández Trujillo Luis Fernando (luistrujillo@unicauca.edu.co), Charo Orozco José Daniel (jdcharo@unicauca.edu.co), Ordoñez Manjarres Cesar Augusto (cesarordonez@unicauca.edu.co), Programa de Biología,  Facultad De Ciencias Naturales Exactas y de la Educación, Universidad del Cauca.                                                                                                                                                                                       Fecha de realización de la práctica: 05-03-2015[pic 2]

RESUMEN

Comprobando el fundamento del método de Lowry; experimentalmente se realizaron mezclas en tubos de ensayo de albumina y agua a diferentes posterior a esto se le adiciono el reactivo de Lowry; (15 minutos) y se procede a agregarle de Folin. Se llevaron a un sitio oscuro (30 minutos), y se procedió a determinar su absorbancia a una longitud de onda de 450 nm. A dos  muestras problemas (una de albumina de suero bovino y otra de albumina de huevo) fue pertinente medir su absorbancia para poder determinar la concentración a la cual fue preparada por medio de la curva de calibración, es pertinente hablar que la absorbancia de las muestras fue directamente proporcional a las concentraciones, es decir, a mayor concentración mayor absorbancia.

Los resultados arrojados fueron acertados y se obtuvo una curva de calibración buena con una ecuación lineal de y=8,9429x + 0,0063 y las concentraciones de las muestras problemas estuvieron alineadas en los rangos de curva de calibración.

INTRODUCCIÓN

Las proteínas son macromoléculas complejas desde los puntos de vista físico y funcional, que desempeñan  múltiples funciones de importancia crucial, integradas por aminoácidos que se unen entre sí por enlace peptídico;  las proteínas  están sujetas a cambios físicos y funcionales que reflejan el ciclo de vida de los organismos en los cuales residen. Una proteína típica nace en el momento de la traducción madura a través de eventos de procesamiento postraduccional, como proteólisis parcial, altera entre estados de trabajo y de reposo por medio de la intervención de factores reguladores, envejece por oxidación, desamidación etc., y muere cuando se degrada hacia los aminoácidos que la componen. (2) (3)

Son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben una amplia gama de estructuras y funciones. Las proteínas como un grupo de biomoléculas que desempeñan una gran variedad de funciones, algunas participan en la contracción muscular y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y almacenan moléculas pequeñas. Los anticuerpos (moléculas que sirven para como protección inmunológica) son proteínas al igual que las enzimas (catalizadores biológicos) y algunas hormonas. Las proteínas pueden llevar a cabo funciones tan diversas por la enorme posibilidad de combinaciones en la composición y secuencia de aminoácidos. (2) (3)

CÁLCULOS Y RESULTADOS.

1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DILUIDA (Cd) DE CADA SOLUCIÒN

Concentración patrón Cp=0,015g/50 mL

Cp=0,30 mg/mL

Vp*Cp= Vd*Cd            Cd=[pic 4][pic 3]

Solución 2.

Cd= = 0,010 mg/mL[pic 5]

Solución 3

Cd= =0,020 mg/mL[pic 6]

Solución 4.

Cd= = 0,030 mg/mL[pic 7]

Solución 5.

Cd= = 0,040 mg/mL[pic 8]

Solución 6.

Cd= = 0,050 mg/mL[pic 9]

Solución 7.

Cd=  = 0,060 mg/mL[pic 10]

Solución 8.

Cd= = 0,070 mg/mL[pic 11]

Solución 9.

Cd==0,080 mg/mL[pic 12]

Tabla 1. Valores de absorbancia y concentración con su curva de calibración.

[pic 13]

[pic 14]

NOTA: El valor de la solución 4 no se encuentra alineada a la curva de calibración, y hace que varíe el coeficiente  de determinación (R2); el cual por lo general disminuye o aumenta hasta 1 de acuerdo a que tan dispersos o alineados estén los valores de absorbancia con respeto a la concentración. Así por ejemplo si se descartara el valor 4 el R2 aumentaría.

1. CÁLCULO DE COEFICIENTE DE CORRELACION (R)

R = [pic 15]

R=[pic 16]

R = [pic 17]

R = 0,9952

=R[pic 18]

R=0,9952

1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN EXPERIMENTAL DE LAS MUESTRAS A PARTIR DE LA ECUACIÓN  

y = 8,9429x + 0,0063 (tabla 1)

Absorbancia albumina de suero de bovino

Grupo 1= 0,336  grupo 3= 0,281    grupo 5= 0,335

Absorbancia albumina de huevo

1= 0,017   2= 0,010    

3= 0,014

X=[pic 19]

Grupo 1.

X= =0,0371[pic 20]

Grupo 3.

X= =0,0307[pic 21]

Grupo 5.

X==0,0368[pic 22]

Muestra 1

X== 0,00120[pic 23]

Muestra 2

X==0,000414[pic 24]

Muestra 3

X==0,000861[pic 25]

1. CÁLCULO DEL PORCENTAJE DE ERROR.

VALOR DE LA CONCENTRACIÓN  REAL.

Muestra albumina problema: 0,040 mg/mL

% error= *100 [pic 26]

%error= *100 =7,25%[pic 27]

%error= *100 =23,25%[pic 28]

%error= *100 =8,00%[pic 29]

DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

Sin duda una de las determinaciones más usadas en la biotecnología es la cuantificación de proteínas, estimar la concentración de las proteínas no solo es necesario en los laboratorios de investigación, sino también en la industria alimenticia, farmacéutica y biotecnológica. En la biología es una técnica de rutina básica que aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades. (4)

Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas, muchos de estos métodos se basan en: la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, para la formación de derivados químicos, y la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. Pero el uso del método adecuado depende de algunos criterios: cantidad total de proteína presente en la muestra, concentración de proteína, la especificidad de  la proteína, presencia de otras sustancias que puedan interferir y  la facilidad y reproducibilidad del método. (4)

Entre los principales métodos están: método de Biuret, método de Bradford, método BCA y el método de Lowry; el cual fue utilizado para llevar a cabo la práctica.

El método de Biuret Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1 Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). (5)

Reactivo de Biuret.

[pic 30]

El método de Bradford Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los detergentes y las soluciones básicas. (6)

Reactivo de Bradford

[pic 31]

El método de BCA El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de formar un complejo púrpura intenso con inones Cu+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en una reacción entre las proteínas con Cu2+ en medio alcalino (reacción de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros métodos. (7)

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