Cuantificacion De Proteinas

Química Biológica para Farmacia y Medio Ambiente

Curso 2008

TRABAJO PRÁCTICO: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

La determinación de proteínas que se realizará en el TP se hará por dos métodos: el de Lowry.

Método de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el mismo está basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).

Estructura química del colorante Coomassie brilliant blue G-250.

Algunas ventajas y/o desventajas del Método

 La intensidad de absorción depende del contenido de aminoácidos básicos y aromáticos.

 El complejo colorante-proteína tiene un alto coeficiente de extinción lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medición de proteínas.

 La unión colorante-proteína es un proceso muy rápido (2min) y el complejo permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rápido, y que no requiere un tiempo crítico para el ensayo.

 Se pueden utilizar un gran número de muestras (muy reproducible) y es adaptable a la automatización.

 Las interferencias o no existen o son mínimas por cationes tanto sodio como potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fácilmente solucionable con la utilización de buffers). Los únicos componentes encontrados que dan una excesiva interferencia en el color del ensayo, son altas concentraciones de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.

Método de Lowry: (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas.

Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces peptídicos de las proteínas y se reduce a Cu+. El Cu+ así como los grupos R de Tirosina, Triptofano y Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reacción ocurre en medio ácido.

Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: ácidos fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) serán interferentes de la reacción. Las proteínas producirán distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido de Tyr y Trp.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

En el trabajo práctico usted realizará una curva de calibración con alguno de los métodos anteriores y con el mismo determinará la concentración proteica de una muestra problema.

A- MÉTODO DE LOWRY

Preparación de reactivos

Reactivo A = Na2CO3 2% P/V en NaOH 0,1N.

Reactivo B = CuSO4 0.5% P/V en tartrato de sodio y potasio 1% P/V.

Reactivo C = 50 ml de A + 1 ml de B.

Reactivo D = Folin diluido al medio con H2O bidestilada (HCl 0,2N)

Solución stock de seroalbumina bovina (BSA)

Se prepara un patrón stock de BSA

...