DESARROLLO DEL MARCADOR DE POLIMORFISMOS DE UN SOLO NUCLEÓTIDO DEL GEN Lr1 DE RESISTENCIA A LA ROYA EN LA HOJA DEL TRIGO

Artículo para exposición:

DEVELOPMENT OF THE SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER OF THE WHEAT Lr1 LEAF RUST RESISTANCE GENE

DESARROLLO DEL MARCADOR DE POLIMORFISMOS DE UN SOLO NUCLEÓTIDO DEL GEN Lr1 DE RESISTENCIA A LA ROYA EN LA HOJA DEL TRIGO

TYRKA M, BŁASZCZYK L, CHEŁKOWSKI J, LIND V, KRAMER I, WEILEPP M, WIŚNIEWSKA H, ORDON F. 2004. DEVELOPMENT OF THE SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM MARKER OF THE WHEAT Lr1 LEAF RUST RESISTANCE GENE. Cellular & Molecular Biology Letters, 9: 879 – 889.

El rango de datos disponibles públicamente sobre secuencias de nucleótidos de plantas abre una nueva posibilidad en el diseño de ensayos con SNP. El propósito de este estudio fue identificar mutaciones puntuales en secuencias genómicas cercanamente relacionadas al gen de resistencia Lr1 al roya de la hoja de trigo, y el desarrollo de marcadores moleculares basados en SNPs de extensiones de primers (SNuPE) facilitando la eficiencia de los procedimientos basados en marcadores de selección., ej. La pirámide de genes de resistencia. Los estudios fueron realizados en 37 cultivares de trigo, el conjunto de 41 líneas Thatcher casi isogénicas de trigo de primavera y en 21 individuos de líneas doble haploides (DH) derivadas de “Henika” (Lr1) x “IPG-SW-14”. Se corrió una reacción de minisecuenciamiento con el primer del gen Lr1_98F detectando cuatro genotipos (T, C+T, y “nulo”) en el conjunto de todas las variedades de Triticum aestivum evaluadas. En este estudio, resultó que el alelo T tiene una profunda asociación con el gen Lr1 en un contexto genético.

La enfermedad del roya causada por Puccinia recondita f. sp. tritici es un patógeno importante del trigo común. Una infección de esta enfermedad fúngica puede conducir a graves pérdidas de rendimiento, así que el crecimiento de cultivares resistentes es una aproximación económica y ambientalmente amigable para controlarlo. Más de 50 genes de resistencia a la roya del trigo han sido descritos. El gen Lr1, confiriendo resistencia parcial, fue identificado en la variedad Malakoff y localizado en el cromosoma 5DL. La virulencia de Lr1 es muy común en el norte de América y está presente en diferentes niveles en los países europeos, De esta manera, Lr1 ha sido considerado útil, especialmente en combinación con otros genes Lr, por ejemplo en estrategias  de pirámide de genes. En el presente, el sitio de marcaje de la secuencia blanco (secuence tagged site = STS) de Lr1 es limitado su uso en cultivos, ya que no es específico para el 50% de los cultivares probados. Esto implica la necesidad de un ensayo robusto y específico para la detección de Lr1. Un mapeo de alta resolución condujo a la ubicación de Lr1 a 0.16 cM de la región flanqueada por dos marcadores RFLPs, Xabc718 y Xpsr567. Esto abre la oportunidad de utilizar los datos de la secuencia publicada para la identificación y detección de marcadores de polimorfismos de nucleótidos simples (single nucleotide polymorphism = SNP).

Una variedad de métodos para la detección de SNPs han sido desarrollados. El método de RFLPs puede ser considerado como el primer uso para la detección de mutaciones en sitios de restricción. Desde 1980, una variedad de métodos más y menos sofisticados han sido desarrollados para revelar los polimorfismos de nucleótidos simples. Los métodos de análisis de SNPs basarse en clivajes enzimáticos, hibridación con pruebas alelo-específicas, ligación de oligonucleótidos o una simple extensión de cebadores de nucleótidos, y pueden expresar diferentes métodos de resolución y detección. Una amplificación alelo-específica, reacción en cadena de ligasa (ligase chain reaction = LCR) un análisis heteroduplex, secuenciamiento dideoxi, pirosecuenciamiento, extensión de primer nucleótido-simple, análisis de PCR en tiempo real y escaneo por microarreglos siguen siendo métodos de elección, con diferentes rendimientos y costos.

El secuenciamiento  directo de productos de PCR resulta en el descubrimiento de 1 SNP por cada 31 bp de regiones no codificantes del maíz. Un SNP por cada 540 bp fue detectado en regiones codificantes del trigo. La abundancia de SNPs en cereales los hace extremadamente importante para la creación de mapas genéticos densos. El rango de bases de datos públicas de secuencias abiertas de nucleótidos abre la posibilidad de realizar experimentos con SNP para genes o secuencias de interés. Los proyectos de detección de SNP y validación están en curso para el maíz y el trigo. En trigo, SNPs de ESTs están siendo predominantemente identificados en el marco del consorcio internacional de SNP en trigo. Este método ha sido utilizado para el descubrimiento de SNP en regiones flaqueantes para marcadores microsatélites, y para la validación de SNPs identificados en bases de datos EST conduciendo a la detección intergenómica o intravariedad polimórfica. Un buen número de SNPs han sido identificados en genes de la γ-gliadina y explorados usando amplificaciones de interés alelo-específicas. El método de amplificaciones de secuencias polimórficas discontinuas fue utilizado para detectar SNPs en el gen del trigo común Wx-D1 y el secuenciamiento fue utilizado para detectar SNPs en genes del citocromo P450 de la cebada. Los polimorfismos de nucleótidos simples (SNP) pueden resultar en el cambio de un fenotipo; así, la detección de SNPs en secuencias codificantes, con este potencial para la automatización, puede mejorar enormemente el mejoramiento molecular.

El método simple de extensión de primer contiene varios acrónimos. Esto se basa en la extensión de un primer específico con dideoxinucleotidos (s) marcados después del annealing del producto de PCR. El primer termina una base antes de la mutación a ser analizada, y utiliza ddNTPs con diferentes marcajes, la fluorescencia permite la detección simultánea de diversas variantes alélicas incluyendo heterocigotos en una simple reacción. En este estudio, los datos de secuencias para T. tauschii BAC library, obtenidos después del corrido con la prueba PSR567, fue utilizada para escoger los marcadores de SNP para la detección de Lr1 en trigo común. El propósito de este estudio fue 1) la identificación de mutaciones puntuales en secuencias genómicas cercanamente relacionadas al gen de resistencia Lr1 del roya del trigo basado en información obtenida de las bases de datos de secuencias; y 2) el desarrollo de marcadores de SNP utilizando el método de extensión de primers para ayudar a los mejoradores en el proceso de de orientación en las selección de genes de resistencia en pirámide.

Taller:

1. ¿Cuál es el objetivo principal de este estudio?

R//Primero, identificar mutaciones puntuales de un solo nucleótido en el ADN genómico cercanamente relacionado con el gen Lr1 de resistencia a la roya del trigo. Segundo, el desarrollo de marcadores SNP basados en la extensión de primers facilitando los métodos de selección basados en marcadores moleculares.

1. ¿Cuál es la ventaja principal de trabajar con líneas doble haploides?

R//  El uso de la técnica de dobles haploides en mejoramiento de plantas tiene el potencial de acortar los ciclos de mejoramiento genético en comparación a los métodos convencionales, mediante la producción rápida (un ciclo) de líneas homocigóticas provenientes de poblaciones segregantes, lo que conlleva a la rápida homogeneización y estabilización genética respecto a los métodos tradicionales que pueden tomar varios años (de 6 a 20 años).

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