Determinación de la actividad específica y de la cinética enzimática de una enzima oxidorreductasa

Introducción:

Los catalizadores son sustancias que aumentan la rapidez o velocidad de una reacción química, sin verse alterada ella misma en el proceso global. Las enzimas son catalizadores biológicos.(Mattews)

Las enzimas están en el centro de todos los procesos biológicos, actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las que se degradan nutrientes, se conserva y se transforma la energía química y se fabrican macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos. La medición de la actividad específica en los seres humanos puede diagnosticar ciertas enfermedades.    (Citar lenninger)

Las enzimas son catalizadores extraordinarios, los aumentos de velocidad conseguidos por las enzimas son de 5 a 17 órdenes de magnitud. Las enzimas son también muy específicas, discriminan fácilmente entre sustratos con estructuras muy similares.

En bioquímica se utilizan diversos métodos para estudiar el mecanismo de acción de enzimas purificadas.  El método más antiguo para estudiar mecanismos de reacción enzimáticos consiste en determinar la velocidad de la reacción y el modo en que esta cambia en respuesta a cambios en los parámetros experimentales,  actividad conocida como cinética enzimática.  Uno de los principales factores que afectan la velocidad de una reacción es la concentración de sustrato presente. Uno de los efectos de la concentración de sustrato es complicado ya que [S] cambia durante el transcurso de la reacción a medida que el sustrato [S] se convierte en producto. [pic 2][pic 3][pic 4]

Objetivo:

Extraer y medir la actividad de la polifenol oxidasa.

Se realizará una cinética enzimática de la enzima polifenol oxidasa.

Metodología:

Preparación de la solución  amortiguadora de pH

1. Se disolvieron  3.39g de fosfato monopotasico (KH2PO4) EN AGUA DESTILADA
2. Se disolvieron  3.53 g de fosfato disodico anhidro(Na2HPO4) en agua destilada
3. Se mezclaron  las dos soluciones.
4.  SE DILUYO A UN 1L.

Preparación de  catecol 0.175M

1. Se disolvieron  0.963375g de catecol
2. se diluyo el catecol  a 50ml de agua destilada.

Extracción de polifenol oxidasa

1. Se tomaron 10 g de la muestra(manzana) y se homogeneizo  con 40 ml de la solución amortiguadora de fosfatos(0.2 M,pH6.86) con ayuda de una licuadora convencional
2. Se realizó un centrifugado durante 30 minutos a 3000rpm y se tomó el sobrenadante de los tubos falcon.

Determinación de la actividad de la polifenoloxidasa

1. En un tubo  de ensayo se colocaron 2ml de la solución amortiguadora de fosfatos, 1 ml de catecol (0.175 M) y 0.5 ml del extracto obtenido.
2. Se midió el incremento de absorbancia a 420 nm con ayuda de un espectrofotómetro cada 10 segundos, este paso se realizó 10 veces.

Determinación de la actividad de la polifenol oxidasa para realizar la cinética

1. Se colocaron 2 ml de solución amortiguadora de fosfatos a 6°C, 1ml de solución de catecol (cada equipo realizo una medición de absorbancia con diferentes concentraciones de catecol) y 0.5 ml de extracto de enzima.
2. Se colocó 1ml de muestra en una cubeta.
3. Se midió el incremento de absorbancia  a 420 nm con un espectrofotómetro a intervalos variables (una medición  cada 30 segundos por 4 minutos).

Resultados:

 Actividad de la polifenol oxidasa

[pic 5]

U=m(2000)[pic 6]

U=0.0037(2000)= 7.4

Actividad cinética enzimática de  la polifenol oxidasa

• Velocidad de reacción para la concentración de 0.02 M

  [pic 7]

U=0.0006(2000)= 1.2

• Velocidad de reacción para la concentración de 0.04 M[pic 8]

U=0.0006(2000)= 0.8

• Velocidad de reacción para la concentración de 0.06 M

[pic 9]

U=0.0006(2000)= 0.8

• Velocidad de reacción para la concentración de 0.08 M[pic 10]

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