PRÁCTICA N°1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN LA UREASA
Enviado por Renzo Hurtado • 12 de Agosto de 2020 • Síntesis • 969 Palabras (4 Páginas) • 443 Visitas
PRÁCTICA N°1
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EN LA UREASA
- INTRODUCCIÓN
Las enzimas son biocatalizadores específicos de las naturalezas proteicas que provocan las aceleraciones en las reacciones químicas, generando cambios físicos, durante esta; pero recuperando su forma original cuando dichas reacciones han culminado. Generalmente, una reacción química catalizada por una enzima se represente de la siguiente manera:
SUSTRATO + ENZIMA = COMPLEJO ENZIMA – SUSTRATO = ENZIMA + PRODUCTO
La ureasa fue aislada y cristalizada en 1926 por el bioquímico estadounidense James Batcheller Sumner, la cual obtuvo a partir de frijoles. Esta se puede aislar de vegetales, moho y bacterias, no encontrándose presente en la célula de los mamíferos; además esta actúa sobre enlaces carbono – nitrógeno (C – N) diferente de los enlaces peptídicos y cataliza la siguiente reacción ÚREA + H2O = CO2 + 2NH3, pudiendo ser inhibida por iones de plata, mercurio y otros metales pesados. Se señala que un reductor suave como el sulfito produce su inactivación reversible.
Una unidad de ureasa se define como aquella que libera una micro mol de amoniaco a partir de úrea, por minuto, bajo condiciones de ensayo específica de pH y temperatura (pH 7.2 y 37°).
- OBJETIVOS
El objetivo de esta práctica es observar la determinación de la actividad enzimática en la ureasa.
- MATERIALES Y MÉTODOS
- MATERIALES
- Material Biológico. Enzima Ureasa (E.C.3.5.1.5. Úrea amidohidrolasa)
- Material y Equipo de Laboratorio:
- Gradillas para tubos.
- Tubos de ensayo de 13 x 100 mm (07)
- Pipetas de 1 ml (02; una al 1/100), 2 ml, 5ml y 10ml.
- Baño María a 37o C.
- Goteros o pipetas descartables de plástico.
- Pizeta con agua destilada.
- Espectrofotómetro o Fotocolorímetro.
- Reactivos:
- Buffer Tris- HCl 0.05 M, pH 7.2
- Solución de urea 0.075 M en buffer Tris - HCl 0.05 M, pH 7.2
- Solución de ureasa 0.05%
- Solución de HgCl2 1% o Solución de rojo de metilo 0.04%.
- MÉTODOS
- SISTEMA DE INCUBACIÓN
COMPONENTES (ml) Y PROCESO | TUBOS | |
1 | 2 | |
Buffer Tris – HCl 0.05 M ph 7.2 | 0.5 | 0.5 |
Úrea 0.075 M bufferada | 3.0 | 3.0 |
Mezclar y pre-incubar a 37°C por 5 minutos. | ||
Ureasa 0.05% | … | 0.5 |
Mezclar suavemente incubar a 37°C por 15 minutos. | ||
Hg Cl2 1% mezclar | 2 gotas | 2 gotas |
Ureasa 0.05% | 0.5 | … |
Mezclar, preparar y seguir con los siguientes sistemas. |
- VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR EL MÉTODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS
- Cuantificación de producto formado. Reacción de Neutralización
Se pasa 2 ml de contenido del tubo 1(control o blanco) a otro tubo marcado (1B), se añade una gota del indicador rojo de metilo al 0.04% y se titula con HCl 0.05 N (usar una pipeta de 1 ml graduada al 1/100). El punto final es la aparición de un color rosa pálido. Se nota el volumen del ácido gastado, el cual se restará del valor de titulación a obtener en el tubo 2. Este blanco representa el ácido necesario para neutralizar los componentes del medio inicial. Luego se pasa 2 ml del contenido del tubo 2 (problema) a otro tubo marcado (2B) y se procede a titular como en el paso anterior. Como se produce una base en esta reacción, el tubo experimental problema (tubo 2) necesita más ácido para lograr la neutralización.
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