Determinación De Proteínas, método De Biuret

• Objetivos:

- Determinar la concentración de Albumina de una muestra problema a través del fotómetro.

- Aplicar técnicas de espectrofotometría para la búsqueda de concentración de una muestra problema.

• Introducción:

Las proteínas son biopolímeros formados por un gran número de unidades estructurales simples repetitivas llamadas aminoácidos. Desempeñan un papel fundamental en los seres vivos y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan la enzimática, hormonal, transportadora (hemoglobina), defensiva (anticuerpos), estructural (colágeno), etc. El siguiente laboratorio consiste en determinar la concentración de una proteína (Albumina) en una muestra problema cuya concentración es desconocida, utilizando como referencia una batería de tubos que contienen soluciones de Albumina y agua, y cuyas concentraciones de Albumina son conocidas, además de esto utilizaremos el blanco fotométrico con el fin de obtener un patrón estándar.

• Determinación de las proteínas:

Existen diversos métodos analíticos para determinar la concentración de proteínas en solución, dependiendo de la concentración de proteínas de la muestra problema, la cantidad de muestra disponible y si se desea recuperar o no la muestra. A continuación, se mencionan los métodos espectrofotométricos y sus características, más comúnmente usados en investigación:

Método Rango  (nm) Carácter destructivo

Absorción UV 0,1 -0,6 mg/mL 280 No

Bradford 0 - 50 ug/mL 595 Si

Lowry 5 - 100 ug/mL 720 Si

Turbidimétrico 0,1 -3 mg/mL 540 Si

Biuret 0,5 -10 mg/mL 540 Si

• Método de Biuret:

En soluciones alcalinas fuertes, el compuesto llamado biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2 ) reacciona con el sulfato de cobre (CuSO4) dando un compuesto de color violeta. Esta reacción, llamada reacción de biuret es muy general, ya que la dan positiva todos los compuestos que se asemejan estructuralmente al compuesto biuret, particularmente las proteínas que, a través de sus enlaces peptídicos, forman un complejo organometálico entre el ión cúprico y el grupo NH del enlace peptídico. Los dipéptidos y los aminoácidos (con excepción de histidina, serina y treonina) no forman complejos coloreados. Los iónes amonio y la urea interfieren en la reacción dando “falsos positivos”. En las muestras biológicas, prácticamente no hay otras sustancias, fuera de las proteínas, que den positiva la reacción de biuret, de modo que este método se puede utilizar para la determinación cuantitativa de proteínas en solución, entre los límites de concentración de 50 mg % a 1.000 mg %, en la solución problema.

Para este laboratorio trabajaremos con el método de Biuret, pero también utilizaremos el fotómetro, debido a esto repasaremos sus principales características. El fotómetro es un instrumento utilizado para medir la absorbancia de un compuesto, el cual está en una solución acuosa, a una determinada longitud de onda, para su uso es necesario tener en cuenta lo siguiente:

 Se debe enchufar el fotómetro y esperar 15 minutos antes de utilizar.

 Una vez calentado el fotómetro, se procede a colocar el 0 mecánico.

 Luego se procede a seleccionar la longitud de onda que se requiera.

 Para terminar se introduce el tubo con el blanco y se llega al 100% de transmitancia.

 Finalmente con el botón “MODE” se cambia a absorbancia y se verifica que este en valor 0.

• Procedimiento:

Soluciones Bco. 1 2 3 4 5(MP)

Estándar Albúmina 1% p/v -- 0.25 0.50 0.75 1.00 --

H2O 1.00 0.75 0.50 0.25 -- --

Muestra de Proteínas -- -- --

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