Digestión de pDEST-32 con EcoRI y HindIII a partir del aislamiento y purificación del plásmido..
Enviado por JonhyFlores • 6 de Diciembre de 2016 • Documentos de Investigación • 2.466 Palabras (10 Páginas) • 1.365 Visitas
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Digestión de pDEST-32 con EcoRI y HindIII a partir del aislamiento y purificación del plásmido.
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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Departamento de Ciencias Biológicas Sección de Bioquímica y Farmacología Humana [pic 3] | Aislamiento y Purificación de Plásmidos Digestión de DNA con Endonucleasas de Restricción |
Digestión de pDEST-32 con EcoRI y HindIII a partir del aislamiento y purificación del plásmido.
Laboratorio de Genética Molecular de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán- UNAM. Cuautitlán Izcalli, Estado de México.
PALABRAS CLAVE. Topoisomero,enzima de restricción, miniprep, pDEST32, EcoRI, HindIII, NEBCutter | ____________________________________________________ Resumen. Existe una gran variedad de métodos para el aislamiento de ADN plasmídico, en particular para aquellos plásmidos encontrados en bacterias, todos incluyen tres etapas comunes: crecimiento de las bacterias y amplificación del plásmido, cosecha, lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico. Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen; permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas.En este estudio el objetivo principal fue purificar DNA plasmídico de una cepa de E.coli utilizando la técnica de miniprep y posteriormente la realización de una digestión del plásmido utilizando las enzimas de restricción HindIII y EcoRI, los resultados fueron analizados en una electroforesis en gel de agarosa en donde se identificaron el número de fragmentos generados y los diferentes topoisómeros, haciendo la comparación entre los resultados experimentales y los resultados esperados obtenidos mediante la herramienta NEBcutter. La digestión con EcoRI nos arroja tres fragmentos de: 5137, 3779 y 3350 nucleótidos; con HindIII solo se hace el corte que abre el plásmido y con ambas enzimas se obtuvieron tres fragmentos de 5137, 3779, 2282, y 1068 nucleótidos. La digestión con las enzimas fue satisfactoria para la mayoría de los equipos. |
KEY WORDS. Topoisomer, restriction enzyme, miniprep, pDEST32, EcoRI, HindIII, NEBcutter | ____________________________________________________ Abstract. A variety of methods for isolating plasmid DNA, particularly those plasmids found in bacterias, all those methods have three common steps;bacteria growth and plasmid amplification, harvesting and lysis of the bacteria and purification of plasmid DNA.Restriction enzymes, also known as endonucleases are enzymes that cut phosphodiester bonds of genetic material from a recognized sequence, can cut double-stranded DNA, which recognize palindromic sequences.In this study the main objective was purified plasmid DNA of an E. coli strain using the miniprep technique and subsequently carrying out a digestion of the plasmid using the restriction enzymes EcoRI and HindIII, the results were analyzed in agarose gel electrophoresis where the number of fragments generated were identified and various topoisomers, making the comparison between the experimental results and expected results obtained by NEBcutter tool . |
Introducción.
Los plásmidos son moléculas de DNA extra cromosómico, circular y de tamaño pequeño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico; no son necesarios para la viabilidad de la célula pero pueden tener genes que le confieran al microorganismo mayores capacidades de supervivencia, como la resistencia a antibióticos. Los plásmidos constituyen una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se pueden usar como vectores para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta forma amplificarlo y obtener grandes cantidades de ADN puro que tendrá utilidad para sintetizar en grandes cantidades proteínas de interés, como la insulina o los antibióticos, mediante un procedimiento conocido como transformación, lo que genera DNA recombinante. (Fonseca, 2010)
Existen diversos métodos para el aislamiento de plásmidos, los llamados Minipreps o mini preparaciones de plásmidos, permiten la recuperación de plásmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. Un método estándar rápido para la obtención de DNA plasmídico comprende cuatro etapas:1) Cultivo bacteriano, en el cual la estirpe bacteriana contiene un plásmido de resistencia a antibióticos.2) Lisis celular, donde las bacterias se tratan con sustancias que fragmenten la pared celular formando protoplastos, que al volver a lisarse liberan DNA plasmídico intacto y parte de DNA cromosómico fragmentado. 3) Desnaturalización del DNA en presencia de sales y conservación del DNA plasmídico, y finalmente 4) Renaturalización del DNA plasmídico a pH ácido y exclusión del DNA cromosómico. (Caballero,2013)
Las enzimas de restricción son proteínas de acción catalítica que tienen la propiedad de reconocer secuencias cortas de DNA (de 4 a 6 pares de bases) en el DNA de doble cadena y cortar en todos los puntos donde se encuentra dicha secuencia,se dividen en endonucleasas Tipo I,II y III; las de tipo II son las más utilizadas ya que son capaces de reconocer secuencias nucleotídicas específicas y cortar los enlaces fosfodiéster del DNA de doble cadena, el sitio de restricción es generalmente una secuencia palindrómica de 4-6 nucleótidos. En este estudio se utilizaron: EcoRI y HindIII, las cuales son producidas por Escherichia coli y por Haemophilus influenzae tipo d respectivamente, estas enzimas poseen una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia metilada (al estar la hebra metilada, no hay corte), palindrómicas y asimétricas, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos; HindIII tiene el sitio de reconocimiento 5'-AAGCTT-3’, 3'-TTCGAA-5’ y EcoRI 5'-GAATTC-3’ ,3'-CTTAAG-5’ (Ibarra,2013) Las enzimas de restricción, al igual que los plásmidos son una herramienta básica en Biología molecular: en laboratorios de PCR, creación de sondas para hibridación, laboratorios de secuenciación de ADN, ingeniería genética, procesos de clonación, manejo de genotecas y en muchas otras áreas de genómica.(Pierre,2006)
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