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La clonacion en el ADN del bacteriofago lambda

Los genes de hemoglobina fueron inicialmente separados de la mayoria de los genes en la preparación de ADN clonandolos en ADN del bacteriogafo lambda. Este fago es particularmente atractivo para clonar porque grandes segmentos de ADN extranjero pueden ser insertados en su ADN sin interferir con infectividad; por lo tanto, los clones resultandos podrian contener algunos genes adyacentes, asi como las regiones no codificantes cercanas. En esta parte de la receta del bacteriofago lambda, las particulas fueron primero purificadas por un metodo similar al descrito anteriormente. Después, el ADN fue extraido de las particulas del fago usando muchos de los mismos pasos descritos para la purificación del ADN del conejo. Para hacer espacio para el ADN del conejo dentro de las particulas del virus, el ADN lambda fue acortado (no toda la información en el ADN lambda es requerido por el fago para infectar las celulas bacterianas). El ADN del fago fue cortado en piezas por una endonucleasa de restricción y fragmentos de información faltante, esencial para infeccion fueron descartados. El ADN del conejo tambien fue cortado en pedazos. Después de que el ADN del conejo y del fago fueron mezclados, se añadio ligasa para unir los fragmentos de ADN. La mayoria de las moléculas de ADN resultantes contenian solo ADN del fago, pero ocasionalmente un pedazo de ADN del conejo fue insertado. Cuando las moléculas de ADN fueron recubiertas con proteinas del fago, que fueron formadas in Vitro, fueron despues permitidas para infectar celulas de E.coli. Cuando las celulas fueron esparcidas en agar, los fagos empezaron a separarse de entre ellos. Se formaron placas de los fagos formados en el césped de la bacteria por cada fago reproducido. Cada placa surgio de una particula de fago distinta, y cada placa contenia millones de particulas de fago identicas. Desafortunadamente, muy pocas contenian genes de hemoglobina. El siguiente problema fue localizar las placas que tuvieran esos genes.

En el momento que los genes de hemoglobina fueron clonados, dos formas generales existieron para identificar placas recombinantes. Una dependia del gen clonado expresando su producto de la proteina en la placa. En otros casos la proteina expresada, cataliza una reaccion quimica que causa que una placa cambie a un color particular si la proteina esta presente. Usualmente este no es el caso, sin embargo, anticuerpos especificos deben ser usados para identificar las placas que contengan los genes. Los anticuerpos son moléculas de proteina que pueden específicamente reconocer otras moleculas y unirse a ellas. El segundo metodo general usa sondas de acido nucleico. El ADN en cada placa es probado por su habilidad para volverse hibrido con un acido nucleico complementario para los genes vistos. Generalmente, acidos nucleicos son marcados radioactivamente para facilitar su deteccion.

Obteniendo sondeo de acido nucleico

Un sondeo apropiado de acido nucleico puede obtenerse si el producto de la proteina del gen visto ya fue purificado. La secuencia de aminoácidos por parte de la proteina es determinada y tambien el codigo genetico puede ser utilizado para deducir la secuencia de una pequeña secuencia de ADN para ser parte del gen. Un oligonucleotido que tenga esa secuencia después es sintetizado por un procedimiento en donde el nucleotido después de otro, es atado al final de una cadena de crecimiento. Una solucion que

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contiene muchas moléculas del segundo nucleotido en la cadena es añadida a la columna bajo condiciones en que el segundo nucleotido se une al primero.

Cada una de las moléculas del segundo nucleotido tiene un grupo de atomos atados que previenen que la cadena crezca mas. Después la columna es lavada para quitar cualquiera de los dos nucleotidos que

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