ENSAYO DE DECOLORACIÓN CON EL RADICAL CATIÓNICO ABTS∙

METODOS ANTIOXIDANTES

3.2.2.2. Actividad atrapadora del radical libre DPPH●

El DPPH es un radical estable de color violeta, cuya absorbancia disminuye al ser reducido por un antioxidante (AH): |

DPPH● + AH → DPPH-H + A●

La capacidad antioxidante de las muestras, se cuantifica midiendo el grado de decoloración de una disolución metanólica de DPPH● (20 mg/L), a una longitud de onda de 515-517nm [22, 23].

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Figura 1. Estructura del radical libre 1,1-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH●).

El ensayo se llevó a cabo utilizando 10 μL de extracto y 990 μL de la solución de DPPH. Cada tratamiento se evaluó por cuadruplicado y como referencia del reactivo se usó la misma cantidad de DPPH y 10 μL del solvente de la muestra. Luego de 30 minutos de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 517nm. El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera:

% de inh = [1- ((Abs muestra – Abs blanco muestra)/ (Abs referencia – Abs blanco ref.))] x100

Los extractos o compuestos puros fueron evaluados a una concentración inicial de 100mg/l y para aquellos que presentaron los mayores porcentajes de inhibición se calculó la concentración inhibitoria del 50% (IC50), definiéndose ésta como la concentración de muestra requerida para disminuir en un 50% el contenido inicial del radical, expresada como μMol del compuesto [24].

3.2.2.3 ENSAYO  FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power)

Este método evalúa la capacidad antioxidante de una muestra de acuerdo a su capacidad para reducir el Fe+3 presente en un complejo con el TPTZ  hasta la forma ferrosa (Fe+2), que presenta un máximo de absorbancia a una longitud de onda entre 590 - 595nm [25] 

Este ensayo se llevó a cabo en un buffer ácido acético-acetato de sodio (pH 3.4), que contiene TPTZ y FeCl3. Se utilizan 900 μl de ésta solución, 50 μl de muestra y 50 μl de agua destilada. Luego de 30 minutos de reacción se determina la absorbancia a una longitud de onda de 593nm. Para cada muestra se tuvo en cuenta la lectura de la absorbancia del blanco sin cromóforo, de la misma manera que en las pruebas anteriores. La curva de referencia se construyó usando acido ascórbico como patrón primario. Las actividades de las muestras en estudio se expresaron como valor FRAP (mg de Acido Ascórbico por cada 100 g de antioxidante) 

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Figura 2. Reacción método FRAP.

3.3.1.2 ENSAYO DE DECOLORACIÓN CON EL RADICAL CATIÓNICO ABTS∙+

Este ensayo se fundamenta en la cuantificación de la decoloración del radical ABTS●+, debido a la interacción con especies donantes de hidrógeno o de electrones. El radical catiónico ABTS●+ es un cromóforo que absorbe a una longitud de onda de 415 ó 734nm y se genera por una reacción de oxidación del ABTS (2,2’ -azino- bis-(3-etil benzotiazolin -6- sulfonato de amonio) (3,5 mM) con persulfato de potasio (1,25 mM). Las mediciones se realizan a una longitud de onda de 734 nm.

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Figura 1. Reacción de antioxidantes con el radical ABTS●+.

En la evaluación se utilizaron 20 μl de extracto y 980 μl de la solución del radical ABTS●+. A los 30 minutos de reacción a temperatura ambiente y en la oscuridad, se leyó el cambio en la absorbancia respecto a la referencia del reactivo, a una longitud de onda de 734nm. La referencia del reactivo consistió en una solución del radical ABTS●+ con el solvente de la muestra. Para las muestras se determinó la concentración inhibitoria del 50%  (IC50) [14]. 

3.3.1.3 PEROXIDACIÓN LIPÍDICA INDUCIDA POR Fe/Ascorbato

Los homogenatos de hígado de rata fueron preparados a partir de machos wistars que pesaron entre 200-250 g. Los animales fueron mantenidos a temperatura ambiente, con luz y alimento controlado. El homogenato de hígado se preparó por técnicas de centrifugación estándar como lo describen Slater and Sawyer [15]. Las ratas fueron sacrificadas con éter etílico como anestésico y el hígado extraído lavado con hielo salino, removido y pesado.  El hígado porcionado fue diluido con 4 volúmenes de buffer 0.1M en fosfato potásico (pH = 7.4), que contiene KCl al 1.15 w/v. El homogenato fue centrifugado a 2500 rpm por 10 min. La suspensión fue almacenada y mantenida a 70°C  durante dos meses. El contenido de proteínas fue cuantificada por el método de Lowry, usando albúmina de suero de bovino (BSA), como patrón [12].

La peroxidación lipídica fue medida según el protocolo de Halliwell [16]. Se mezclaron homogenato con Tris-HCl 0.1M  (2mg/ml). La peroxidación fue inducida FeSO4 (5 μM) y ascorbato de sodio (500 μM). Las muestras por triplicado fueron incubadas a 37°C por 20 min. Los productos de peroxidación lipídica fueron detectados con acido tiobarbitúrico y la absorbancia medida a 532 nm [17]. La incubación se hizo con las respectivas concentraciones de las muestras disueltas en DMSO y sus respectivos controles. El Butil hidroxi tolueno fue usado como referencia.

3.3.1.4 ACTIVIDAD PARA ATRAPAR EL RADICAL EL ANIÓN RADICAL SUPEROXIDO

La medida de la actividad atrapadora del radical superoxido, fue hecha basada en el método descrito por Yamagushi et al [18], con algunas modificaciones. Se mezclaron 0.25 mL de una solución de nitro blue tetrazolium (NBT)  (156 μM in 100 mM phosphate buffer, pH=7.4) con 0.25 mL of solución de NADH  (468 μM in 100 mM buffer fosfato,  pH=7.4) y 1 mL de muestra disuelta en metanol a diferentes concentraciones. A la mezcla anterior, se adiciona 1 mL de metasulfato de fenazina (PMS) (60 μM en 100 mM buffer fosfato,  pH=7.4) , para iniciar la reacción.  La catequiza, se usó como referencia. La reacción fue incubada a 25 ºC y la reacción coloreada los radicales superoxidos y el fue medida a  560 nm, con un control cinético a los 5 minutos. La cinética de esta reacción es una doble reciproca, donde la pendiente de la curva/pendiente del control es el efecto total de cada concentración. El porcentaje de inhibición es calculado por la siguiente expresión:

[pic 4]

Donde ms es la pendiente de cada concentración y mc es la pendiente del control. El IC50 fue calculado a partir de una regresión exponencial, donde la abcisa representa la concentración y la ordenada el porcentaje de inhibición.

3.3.1.5 ENSAYO DE LA INHIBICIÓN DE XANTINA OXIDASA

La actividad para inhibir el sistema xantina oxidasa/xanthina fue medida de acuerdo al método de Noro et al [19]. La mezcla de reacción fue 0.1 mL of isoespintanol a diferentes concentraciones, 0.3 mL de buffer fosfato de  pH = 7.5 (50 mM) y 0.1 mL de xantina oxidasa (0.5 unit/mL) en buffer fosfato de  pH = 7.5 (50 mM). La mezcla se incuba a 25°C por 15 min, y la reacción se inicia con la adición de 0.3 ml HCl 1N., se mide la absorbancia a  290 nm. Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que produce 1μM de acido úrico por minuto a 25 °C. La actividad de la enzima se define como:

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Donde, A es la actividad de la enzima sin muestra y B es la actividad de la enzima con muestra

3.3.1.6 ENSAYO DE DECOLORACIÓN DE β-CAROTENO

Esta técnica fue desarrollada por y modificada Rosas et al 1999 [20]; está basada en la decoloración de β-caroteno en la presencia de metil-linoleato o ácido linoleico como sustratos oxidables en una emulsión acuosa que usa tween 20 como agente emulsificante. La técnica es sencilla, rápida y se usa una mínima cantidad de reactivos y equipos de fácil acceso. La técnica se fundamenta en la decoloración del beta caroteno debida a su reacción con los radicales libres formados del proceso de oxidación del ácido linoleico o metil linoleato, usados como sustratos oxidables. En esta reacción los radicales destruyen la conjugación del beta caroteno, disminuyendo su capacidad de absorción a 455 nm [21].

Emulsión de β-caroteno: En el ensayo se mezclan, 1 mL de una solución de β-caroteno (0.2mg/mL de cloroformo), los cuales  se adicionan a un balón volumétrico de 100 mL que contiene 15 μL de metil linoleato y 0.2 mL de Tween 20; la mezcla se lleva a sequedad. Al residuo resultante se le adicionan 100 mL de agua suprapura previamente saturada con oxigeno.

Referencia Control Rc: Contiene 1.9 mL de la emulsión de β-caroteno y 100 μL

Muestra referencia Rs: Contiene 1.9 mL de la emulsión de β-caroteno y 100 μL

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