“ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

                 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 1][pic 2]

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Laboratorio de Métodos de Análisis

Práctica # 4 “ESTUDIO DE ALGUNOS FACTORES QUE AFECTAN EL ESTABLECIMIENTO DE UN MÉTODO^[a] ESPECTROFOTOMÉTRICO”

5IV1

Alumno:

Mendoza García Francisco Oswaldo

Profesores:

Hernández Derramadero Fernando

Olguin Ruiz Gabriela Edith

Rodríguez Páez Lorena Ignacia

INTRODUCCION

La espectrofotometría^[b] es una técnica utilizada en los laboratorios para el análisis cuantitativo de numerosos compuestos, debido a su sencillez operativa y a la rapidez en el análisis. El fundamento de la espectrofotometría se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio. Por ello para que se puedan generar datos confiables es de gran importancia la verificación previa de este.

A la hora de medir la absorbancia o transmitancia de las soluciones podemos encontrarnos con dos tipos de sustancias, las coloridas, aquellas que absorben la luz visible y por lo tanto se pueden medir mediante procedimientos colorimétricos y las no coloridas o bioquímicamente incoloras, este tipo de sustancias a menudo pueden convertirse en compuestos coloreados adecuados para reacciones cromogénicas formadoras de color para producir compuestos adecuados para el análisis colorimétrico. Sin embargo, también pueden diseñarse para medir la difusividad en cualquiera de los rangos de luz listados que usualmente cubren alrededor de 200 nm – 2500 nm usando diferentes controles y calibraciones. El espectro de absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula.

Pueden llegar a existir una gran variedad de factores que originan variaciones entre los datos de absorbancia y transmitancia, algunos pueden ser el pH, la polaridad del solvente o moléculas vecinas, la orientación de los cromóforos vecinos, así como el tiempo óptimo para la producción total del color y el intervalo de tiempo en que éste es estable. Las variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto de este sobre la ionización del compuesto.

Actualmente existen dos leyes que rigen el comportamiento de la fracción de radiación absorbida al pasar a través de la materia, la ley de Lambert que se refiere al espesor de muestra y al efecto sobre la radiación que se absorbe, y la ley de Beer que está relacionada con el efecto de la concentración de la muestra sobre la absorción. Gracias a la elaboración de la curva de calibración y el tratamiento adecuado de los métodos espectrofotométricos podremos verificar la ley de beer. De la misma forma gracias al método de Ringbom se podrá obtener el intervalo útil de concentración, la sensibilidad, el error fotométrico del método y el límite de detección.

La mayoría de los instrumentos se suministran con sus propias celdas, algunos tienen un adaptador que permite utilizar tubos comunes de laboratorio, de dimensiones apropiadas, como cubetas en el espectrofotómetro. Para el uso de éstos, deberá verificarse que posean superficies ópticas equivalentes y un diámetro interno equivalente, de tal manera que el paso de luz en todos los tubos sea el mismo.

OBJETIVOS

1. Identificar algunos de los factores que intervienen en el establecimiento de un método espectrofotométrico.
2. Elegir los parámetros óptimos para la aplicación del método espectrofotométrico.
3. Observar el procedimiento para la selección de tubos de laboratorio para ser utilizados como celdas en un espectrofotómetro.

DESARROLLO

1. Selección de tubos para ser usados como cubetas.

Lo primero que hicimos fue seleccionar 25 tubos con una superficie homogénea y paredes de igual grosor en toda la circunferencia, seleccionamos la longitud de onda de 400 nm y les adicionamos 5 ml de agua destilada. Se ajusto el espectrofotómetro a 0 y se llevo la transmitancia a una lectura del 95% con el tubo 1, se colocó otro tubo en el espectrofotómetro y se realizo otra lectura la cual no variara en ± 2%T esto se hizo rotando el tubo hasta obtener la transmitancia esperada, se repitió este procedimiento con los tubos restantes y se anoto la lectura de transmitancia, de los tubos anteriores se seleccionaron 13 los cuales dieron una lectura de 95 ± 2 %T.

Finalmente, para que los tubos puedan ser utilizados como cubetas deben poseer un diámetro interno equivalente, por lo tanto, a 12 de los trece tubos se les adicionaron 5 ml de una solución de NiSO4 al 4%, se ajustó el espectrofotómetro al 100% de transmitancia usando agua destilada como blanco, se realizó la lectura de Transmitancia de cada tubo a 400 nm y al final se seleccionaron 10 tubos cuyas lecturas no variaran más del 2%.

Tabla No. 1 “Estabilidad el color en función del tiempo”

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