EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN ELECTROFORETICA DE PLASMIDOS BACTERIANOS

INTRODUCCIÓN

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, circular y generalmente de pequeño tamaño que se encuentran en muchas especies bacterianas y que se pueden replicar de manera independiente del DNA cromosómico. A diferencia de éste, los plásmidos no son necesarios para la viabilidad general de la célula, pero pueden contener genes que contribuyen a la supervivencia en condiciones especiales, como los que confieren resistencia a antibióticos, a metales etc. Algunas clases de plásmidos poseen además la propiedad conocida como "replicación relajada", esto es, están presentes en forma de muchas copias por célula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificación.

El ADN de una cepa bacteriana, puede ser extraído de las células por diferentes procedimientos y puede separarse el ADN cromosómico del plasmídico. Con un extracto de ADN plasmídico, puede realizarse una corrida electroforética y visualizarse lo que se denomina el “perfil plasmídico” de una cepa bacteriana. Este procedimiento tiene gran aplicación fundamentalmente en epidemiología. A partir de plásmidos obtenidos en el laboratorio, ya sea provenientes de una cepa o construidos artificialmente, es factible transferir información genética contenida en estas moléculas a una cepa bacteriana. Este procedimiento se denomina transformación, y consiste en forzar a una cepa a captar de alguna forma el ADN extraño. Esta captación es en general más eficiente cuando el ADN a incorporar se encuentra como una molécula circular cerrada, por lo que los plásmidos son moléculas ampliamente utilizadas para transferir información de una cepa a otra en el laboratorio.

También las bacterias en la naturaleza, utilizan la transferencia de ADN plasmídico como método habitual para intercambiar material génico, aunque muchas veces está mediado por contacto entre una célula dadora y una receptora (conjugación).

Muchos vectores plasmídicos comúnmente usados en el laboratorio para el clonado de genes de interés (pUC, Bluescript, pGem etc) portan un segmento del DNA de E. coli conteniendo la secuencia regulatoria y la información codificante para los primeros 146 aminoácidos de la beta galactosidasa. Incluida en esta región del plásmido se encuentra el sitio de policlonado del vector, que mantiene el marco de lectura y resulta en la incorporación de unos pocos aminoácidos a la secuencia de la beta galactosidasa.

Este tipo de vectores pueden ser utilizados en cepas de laboratorio que expresan la porción carboxi-terminal de la beta galactosidasa. Una cepa de este tipo por sí sola no podrá expresar la enzima, pero cuando es transformada con el plásmido, la beta galactosidasa podrá sintetizarse de forma completa de manera de ser enzimáticamente activa.

Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003)

OBJETIVO

Al finalizar la práctica el alumno conocerá un método de extracción y purificación de plásmidos bacterianos.

MATERIAL

• Micropipetas de 1-10μl 10-100μl 100-1000μl

• Tubos para micropipetas

• Microtubulos

• Baño de hielo

• Pipetas de transferencia

• Vórtex REACTIVOS

• Cloroformo: alcohol isoamílioco (24:1)

• Isopropanol absoluto

• BD I (solución de lisis)

 Tris HCl 25mM pH 8

 EDTA 10mM

 Glucosa 50Mm

 Agua destilada

• BD II (SDS Alcalino)

 NaOH 0.2N

 SDS 1.0%

 Agua destilada

• BD III (Buffer de acetato)

 Acetato de potasio 5M

 Ac. acético glacial

 Agua destilada

 Agua clorada

PLANTEAMIENTO

El DNA de un plásmido recombinante presente en una bacteria se aísla por un método rápido y sencillo (Birboim y Dolly) que consiste en lisis bacteriana, precipitación de proteínas y DNA genómico, y finalmente precipitación del DNA plasmídico. El objetivo es obtener suficiente cantidad del DNA para su análisis posterior mediante electroforesis.

METODOLOGÍA

• E. Coli DH5α

1) Poner 1ml de sustancia bacteriana en un tubo de 1.5ml y centrifugar a 13,000 r.p.m /3min. 2) Resuspener en 250μl de solución I por pipeteo. 3) Agregar 300μl de solución II y mezclar por inversión. 4) Añadir 200μl de solución III y mezclar por inversión.

8) Añadir 1ml de etanol 70%. Despegar pastilla. 7) Centrifugar a 13,000rpm/5min 6) Agregar 700μl de isopropanol frío y mezclar por inversión. 5) Centrifugar a 13,000rpm/5min

Electroforesis con Agarosa 1% en buffer TAE, 200volts/30min usando tinción de Bromuro de etidio.

9) Centrifugar a 13,000rpm/5min 10) Dejar secar y resuspender en 20μl de TE

RESULTADOS

Revelado y observación

Una vez que el frente de corrida avanzo lo suficiente, se paró la electroforesis, se abrió la cuba y se retiro el portagel. El gel se sumerge en una solución previamente preparada de Bromuro de Etidio durante unos minutos y se

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