El número de folículos aislados por cortador de tejidos difiere según las especies, Biopsia de ovario in vivo

El número de folículos aislados por cortador de tejidos difiere según las especies [52] e incluso entre razas. En cabras y ovejas, los mejores resultados se obtuvieron con los intervalos de 75 y 87,5 m, respectivamente [53,54]. El mejor intervalo para seccionar el tejido ovárico varía de 50 m para el ganado europeo (Bos Taurus; [43] y 125 micras para el ganado cebú (Bos Indicus;. [52] Estas diferencias en cuanto al intervalo de corte más adecuado para aislar folículos preantral puede explicarse por diferencias en la cantidad de tejido ovárico y la variación en su composición, como en los cuerpos lúteos y corpus albicans [43]. folículos embebidos en un estroma más fibrosa pueden ser más difíciles de aislar y de corte intervalos más pequeños serían necesarios [52].
El método microdisección se ha utilizado para aislar folículos grandes bovinos utilizando agujas finas bajo microscopía estereoscópica.

Este método mantiene las capas de células de la teca, lo que garantiza la calidad del folículo [55,56]. En general, la presencia de células de la teca es una condición esencial para el crecimiento folicular normal, la preservación de la producción de estrógenos [57], mantenimiento de la salud folicular, y la remodelación de la membrana basal [58]. Por lo tanto, el mantenimiento de la comunicación entre el ovocito, las células somáticas de los alrededores, y la matriz extracelular es vital para el logro de la foliculogénesis normal, y para mantener el crecimiento folicular y la viabilidad [58]. Esta técnica permite el aislamiento de varios folículos intactos morfológicamente normales y de tejido ovárico. Las grandes folículos preantral bovinos han sido exitosamente aisladas y cultivadas in vitro hasta la formación del antro después [22,58] y largo plazo [20,37-39,59] cultura corto.
aislamiento enzimático
La naturaleza fibrosa de los ovarios de la mayoría de las especies domésticas complica aislamiento folicular [60]. Por lo tanto, algunos estudios han llevado a cabo utilizando diferentes tipos de enzimas para recuperar los folículos preantrales en diferentes especies.
La colagenasa (de Clostridium histolyticum) se ha utilizado para aislar numerosos folículos preantrales de murino [61], porcina [62], y de bovino [43] ovarios. Además, un método enzimático utilizando desoxirribonucleasa (ADNasa) ha sido desarrollado para aislar folículos humanos [63]. Sin embargo, este último proceso requiere un largo tiempo de enfriamiento y por consiguiente reduce la viabilidad de los folículos por causar daño a las membranas celulares.
El grado de daño enzimática depende de la duración del tratamiento, la concentración de la enzima (s), y el tipo de tejido [43,64]. Morfológicamente folículos normales se han aislado a partir de ovarios bovinos utilizando una combinación de colagenasa y ADNasa tratamiento [65]. Sin embargo, se informó de que aunque los ovocitos de folículos preantrales recién aisladas parecían sanos bajo un microscopio invertido, los exámenes histológicos revelaron que el procedimiento enzimático podría haber dañado los oocitos, especialmente en los folículos preantrales más pequeños.

Biopsia de ovario in vivo
Un nuevo método para la recopilación repetida de biopsias ováricas de donantes vivos a través transvaginal, punción ultrasoundguided del ovario ha sido desarrollado y probado con éxito en las vacas [3], las mujeres [66], y recientemente en yeguas [6-8]. Este procedimiento puede ser visto como una versión modificada de una técnica comercial óvulo pick-up (OPU). El uso de biopsias de ovario, Aerts et al. [3] tuvo una tasa media de éxito del 68% para la recuperación de fragmentos de ovario. Aunque más bien pequeño, estos fragmentos fueron adecuados para tanto histológico (Figura 2B) y evaluación inmunohistoquímica y revelaron la presencia de folículos primordiales preantral y crecientes morfológicamente normales. Además, en un estudio posterior, la restauración de la morfología del tejido de ovario (usando microscopía de luz) y la preservación de la viabilidad del folículo (usando microscopía de fluorescencia) en la mayoría de los folículos preantrales después de múltiples sesiones de biopsia de ovario se informó [4].
En los sistemas de cultivo in vitro para los folículos preantral bovina para los bovinos y otras especies domésticas agrícolas, el desarrollo de sistemas de cultivos capaces de soportar el crecimiento de los folículos inmaduros a una etapa en la que podrían ser madurados y los ovocitos fecundados aseguraría una gran cantidad de ovocitos para la manipulación . Estos ovocitos potencialmente podrían utilizarse para acortar el intervalo de generación de animales seleccionados y, en consecuencia, a aumentar el número de crías por animal nacido. Desarrollo de un sistema de cultivo exitoso para preantral folículos con oocitos inmaduros depende de procedimientos eficaces que permitan recuperar los folículos del ovario y la cultura también.
Básicamente, hay dos formas de la cultura de la especie bovina folículos preantral: 1) encerrado en fragmentos de tejido ovárico (rodajas o tiras), también llamado "in situ"; o 2) el uso de folículos aislados. Folículos aislados han sido cultivadas, ya sea en un sistema de dos dimensiones (2D) (Figura 3A) - es decir, el folículo se coloca en la superficie, que puede ser un plástico o de matriz extracelular (por ejemplo, gel de colágeno, matrigel, etc) - o en una de tres dimensiones (3D) del sistema (Figura 3B), en la que los folículos se cultivan dentro de una matriz extracelular.
Actualmente, el uso principal de los folículos aislados para el cultivo es apoyar el crecimiento y desarrollo de los oocitos inmaduros y permitir la comprensión de los mecanismos implicados en el desarrollo del ovocito, la diferenciación de células de la granulosa, y regulación de los factores autocrinos / paracrinos que controlan primeras etapas de la foliculogénesis [67].
El cultivo in vitro de folículos preantrales cerrados en el tejido de ovario (in situ)
En el sistema de cultivo in situ, los folículos se cultivan con el tejido ovárico circundante, incluyendo las células del estroma. Este sistema de cultivo permite la interacción entre los folículos y sus células adyacentes, tales como células de la teca / estroma y células de la granulosa, que pueden influir en su crecimiento [68]. Este es un método muy práctico y evita la exposición prolongada de las células con el medio ambiente externo.
La activación espontánea de folículos primordiales se ha sabido que se producen in vitro utilizando el sistema de cultivo in situ en varias especies, incluyendo ratones [18,69], ganado ([25,70-74], Tabla 1), los caballos [7], cabras [75,76], y primates [77,78]. La mayoría de los folículos primordiales bovinas cultivadas in situ puede activar dentro de los 2 días de la cultura [25,27,70] y llegar a la etapa secundaria en 6 [79], 10 [27,34,80], o 22 días [74] .
A pesar de que el cultivo in vitro de tejido de ovario es capaz de desarrollar folículos primordiales hasta etapas primaria y secundaria [27,34,74,80], esta técnica no ha sido muy eficaz para la maduración del folículo. Un sistema de cultivo en dos etapas para bovina [79] y humanos [81] preantral folículos se ha probado recientemente. El objetivo de este sistema era determinar si en los folículos bovinos y humanos in situ-crecido puedan ser aislados en la etapa secundaria y se cultivan para últimas etapas antrales preantral / temprano. Sin embargo, en ambas especies, sólo unos pocos folículos antrales se obtuvieron después de 4 [81] o 15 días [79] de la cultura de los folículos secundarios.

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