Electroforesis

TP Purificación DNA plasmídico y Electroforesis en gel de agarosa

Departamento de Biología Molecular y Celular, Facultad de ciencias exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires.

Alumnos: Grupo: 7

Los plasmidos son moléculas de ADN pequeñas que se replican y transcriben manera autónoma e independiente del cromosoma de la célula. Estan presentes en organismos procariotas y en algunos eucariotas como levadura. El numero de plásmidos puede variar de una celula a atra, desde una sola copia hasta cientos de ella. La importancia de la aplicación de utilización de plasmidos en biología molecular e ingeniería genética es que estos se utilizan como vectores de clonado, es decir, permite su manipulación de tal manera que se puede introducir fragmentos de DNA foráneo de interés mediante el uso de enzimas de corte específicos para luego amplificarlo.

La electroforesis es una técnica se separación de moléculas en función de su movilidad en un campo eléctrico dependiendo esta de su carga y peso respectivo. En el caso del DNA Plamídico, cuando se encuentra dentro de la bacteria, tiene una forma superenrrollada (CCC), pero esta forma puede cambiar debido a a la ruptura de un enlace fosfodiester en una de las hebras, por lo que quedarán moléculas circulares abiertas (CA) donde ya no hay superenrrollamiento. Si se rompen la dos hebras quedará una molecula lineal (L). Es de uso frecuente la utilización de electroforesis de acidos nucleicos en gel de agarosa, el cual consiste en una matriz poroza que mediante sus poros permite el paso de de las moléculas de DNA según su peso en relación con sus pares de bases (originalmente los acidos nucleicos poseen carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato).

Desarrollo experimental:

Los pasos previos fundamentales para este proceso de purificación de DNA son: lisis-desnaturalización, renaturalización-precipitado, y lavado.

Lisis y desnaturalización: A partir de una cepa de bacterias se llevó a cabo una lisis abrupta mediante el agregado de SDS y NaOH.

Renaturalización y precipitado: Mediante la adición de K⁺ AcO- se renaturaliza el DNA plasmídico y precipita el DNA genómico.

Lavado: Con el agregado de etanol se logra la purificación del DNA de sales, proteínas y demás compuestos.

Seguido de esto por el proceso de electroforesis se hizo correr el DNA plasmídico en gel de agarosa.

Se siguieron los pasos detallados de la guía de TP en las páginas 16,17 para el TP nro2, y páginas 21- 23

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