Electroforesis

Materiales y métodos.

Ensamble:

-Se lavaron y enjuagaron con agua desionizada y alcohol las placas de vidrio de la cámara de electroforesis vertical.

-Se colocaron los separadores entre las dos placas de vidrio.

-En las placas se colocaron los espaciadores, y cuando estuvieron bien ensamblados y alineados se colocaron cuidadosamente dentro del porta geles.

-Antes de comenzar, se verificó que no existieran fugas colocando agua dentro de las placas con una micropipeta, para después desecharla.

-Se agregó el gel separados utilizando una micropipeta de 1000, dejando 2.5 cm antes del borde superior.

-Para alinear el gel, se agregó una capa delgada de agua destilada. -Se dejó polimerizar por 30 minutos, para después eliminar el agua y lavar muy bien con agua destilada.

-Entonces se agregó el gel concentrador con una micropipeta de 1000, se colocó el peine y se dejó polimerizar nuevamente.

-Se colocó el sistema dentro de la cámara de electroforesis, retiramos el peina y se enjuagó con agua desionizada.

-Por último, se colocó el amortiguador de corrida y los geles quedaron preparados para proceder a aplicar las muestras.

Preparación del gel separador al 10%, 20 mL para 1 gel.

-Primero se realizaron los cálculos para la preparación de 1 mini-gel separador por nuestro equipo. -Se agregaron las soluciones según el orden mostrado en la tabla correspondiente, tomando en cuenta que el TEMED y el persulfato de amonio van al último. Para esto, se tenían listas las micropipetas adecuadas con la graduación necesaria para cada sustancia.

-La mezcla se agitó subiendola y bajándola con una micropipeta, teniendo cuidado de no formar burbujas.

-Se colocó la solución entre las dos placas de vidrio hasta 4.5 cm aproximadamente, con una micropipeta de 1000.

-Encima del gel se puede agregar 1 mL de agua desionizada para alinearlo.

-Se dejó polimerizar durante 30 minutos, para después lavar la superficie del gel con agua desionizada.

Preparación del gel concentrador al 4%

-Se hicieron lo cálculos para obtener el volumen necesario de cada solución para un mini-gel y posteriormente se agregaron las soluciones en cierto orden y al último se agregó el TEMED y el persulfato de amonio 10%.

-Se agitó la disolución con la misma micropipeta tomando muestra y desechándola, esto se hizo tratando de no formar burbujas, ya que más oxígeno dentro podía inhibir la polimerización.

-Se colocó la solución entre las dos placas de vidrio llenando el espacio restante y se le colocó el peine.

-Después de esto, se dejó polimerizar aproximadamente por 30 minutos.

-Cuando el gel ya se había polimerizado se guardó a una temperatura de 4°C.

Preparación de las muestras:

-Antes de comenzar, fue necesario dejar descongelar el amortiguador 4x.

-Se prepararon las muestras en microtubos, colocando la leche diluida 1:4, el sobrenadante diluido 1:1 y la caseína purificada junto con el amortiguador 4x según la tabla correspondiente, utilizando las micropipetas.

-Las muestras se hirvieron por 1 minuto colocándolas dentro de un vaso de precipitados de 50 mL con poca agua, sobre un mechero de Bunsen.

-Dentro de cada pozo del gel se cargaron las muestras con la micropipeta de 1000, colocando las muestras de 2 equipos en un gel. -Se conectó la cámara de electroforesis vertical, aplicando 170 V para uno o dos geles, por aproximadamente 45 minutos.

Tinción del gel

-Cuando el gel terminó de correrse, el amortiguador se retiró de la cámara superior y también se retiró el porta placas; y con cuidado se retiraron los separadores de las placas para poder liberar el gel y con ellos mismos se realizó un pequeño corte para que se pudiera observar

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