Electroforesis

Discusión

Es una técnica importante para la separación de proteínas se basa en el desplazamientos de las proteínas cargadas en un campo eléctrico.

Las moléculas mucho mayores quedan casi inmóviles y las moléculas de tamaños intermedios se desplazan a través del gel con diversos grados de dificultad.

Realizamos electroforesis en gel de poliacrilamida con el fin de separar proteínas provenientes de una muestra de suero.

Preparación de la muestra:

Preparación del gel de poliacrilamida:

Como soporte se utilizó poliacrilamida ya que esta tiene características como: ser químicamente inerte, de propiedades uniformes, se prepara de forma rápida, forma geles transparentes, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado. Además de tener la ventaja de que variando la concentración de acrilamida y bis-acrilamida, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro.

En la presente práctica se van a preparar mini-geles de 0,75 mm de espesor. Las cantidades indicadas para la preparación de las soluciones en el anexo corresponden a la preparación de dos geles. Cada uno de ellos consta de un gel concentrador de aproximadamente 2 cm de longitud que contiene los pocillos para cargar las muestras, y un gel separador de aproximadamente 6 cm.

En la figura 4, se ilustra el montaje del sistema de electroforesis, la preparación de los geles y el procedimiento a seguir.

Pureza de los reactivos

El empleo de reactivos de alta calidad y agua

desionizada es un prerrequisito para hacer geles reproducibles y de alta resolución, en particular esto es muy importante para la acrilamida, ya que es el constituyente más abundante del gel y sus principales impurezas son ácido acrílico residual (que puede retardar la movilidad electroforética de algunas proteínas), poliacrilamida lineal e iones

Preparación del gel separador al 10%.

Se mezcla en un matraz (capacidad aproximada de 100 mL) los componentes en el orden que se indica en el anexo I. 2

Con cuidado, utilizando una pipeta Pasteur, se añade la mezcla en el interior del molde hasta una altura aproximada de 2 cm del borde superior de la placa mayor, de forma que quede suficiente espacio para el gel concentrador (se debe calcular 1 cm más de la longitud de los pocillos del peine)

Durante la preparación de esta gel se disminuyó la cantidad de persulfato de amonio al 10% de 24µL a 15µL ya que este tenia se había preparado días antes y por lo tanto afectaba la polimerización de la gel. También se aumentó la cantidad de TEMED de 6µL a 9µL ya que también se veía afectado por el persulfato de amonio.

A continuación, usando una pipeta limpia, se cubre la superficie del gel con isobutanol, isopropanol o agua destilada. Esto previene el contacto del oxígeno con el gel que inhibe la reacción de polimerización.

La polimerización del gel debe de ocurrir en unos 30 minutos.

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico. La velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta (carga total/masa) entre proteínas. Este método se denomina electroforesis zonal. La matriz de poliacrilamida no es un buen soporte para este método pues la migración de las proteínas en su seno no sólo es proporcional a la carga neta sino también al tamaño y forma de las proteínas.

Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.

Algunas características destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son:

Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador

Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además, durante la polimerización se libera calor que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel.

La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) y TEMED (iniciador).

La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use.

El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel. Habitualmente los geles se denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. Así, la mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.

El gel preparado para esta prueba se utilizó al 10%.

En función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético éstas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes.

Una electroforesis desnaturalizante, la más común, es la que somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma.

El agente desnaturalizante:

Empleado en la experimentación durante este laboratorio fue el sodio dodecil sulfato o SDS, un detergente.

Este detergente SDS se une a la mayoría de proteínas en una cantidad aproximadamente proporcional a la masa molecular de la proteína, alrededor de una molécula por cada dos residuos de aminoácidos. El SDS ligado incorpora una gran carga neta negativa, lo que hace que la carga intrínseca de la proteína sea insignificante y confiere a todas las proteínas un cociente carga/masa similar. Además, la conformación nativa de la proteína se altera cuando se fija el SDS y la mayoría de las proteínas adoptan una forma similar.

En algunas proteínas hay puentes disulfuro entre los residuos de Cys (para formar cistinas) de una misma cadena polipéptidica (puentes intracatenarios) o de diferentes cadenas (puentes intercatenarios) de algunas proteínas con estructura cuaternaria. Estos puentes se pueden romper mediante tratamiento con determinados agentes reductores, como por ejemplo, el ß-mercaptoetanol (ß-ME).

¿Qué función tienen el TEMED y el persulfato de amonio?

Unión de la acrilamida con el bis-acrilamida. Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor. Actúan como agentes catalizadores para la polimerización de la gel empleada para la separación de las proteínas en la muestra de suero.

La polimerización se inicia con la formación de radicales libres del monómero, que se producen por radicales libres de oxígeno, por causa de la acción de iones persulfato. Las aminas terciarias como el N, N, N, N´-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reacción, porque causan la formación de radicales libres del persulfato

La velocidad con que el ión se dirige hacia el cátodo o el ánodo.

Comportamiento de una molécula bajo la acción de un campo eléctrico. En un sistema electroforético actúan dos fuerzas opuestas sobre cada molécula con carga eléctrica, la fuerza debida al campo eléctrico y la fuerza debida a la resistencia de la disolución; el resultado de ambas fuerzas es el movimiento del ion a través de la disolución a una velocidad constante.

Fuentes de error en la electroforesis:

La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerización y la corrida del gel, velocidad de la polimerización, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparación de las muestras.

Tiempo de corrida

La determinación del tiempo adecuado de corrida es muy importante, pues corridas muy cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario para su correcta separación, pero también se ha probado que tiempos de corrida cortos minimizan la dispersión de la muestra y el ensanchamiento de la banda.

Determinación de peso molecular de proteínas:

Comportamiento anómalo de diferentes proteínas en electroforesis. El peso molecular (PM) de las proteínas puede determinarse en electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Existen patrones (mezclas de proteínas de peso molecular conocido y que se tiñen uniformemente) de varios rangos de peso molecular, se debe aplicar el que abarque el peso molecular esperado para la proteína que se quiere determinar.

PDF: Electroforesis: electroforesis en papel de proteínas séricas

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de

Córdoba, Avda. Menéndez Pidal s/n, 14004-Córdoba

Anexos:

Tipos de electroforesis

Electroforesis de frente móvil o libre:

Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas

...