Ensayos antimicrobianos de extractos naturales

Ensayos antimicrobianos de extractos naturales y su efecto inhibidor contra Listeria Inocua y bacterias de deterioro de peces, después de su incorporación en películas biopolímeras comestibles.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

Biopolímeros de calidad alimentaria: gelatina tipo A (240-260 Bloom) y

Metil celulosa (A15FG, Methocel) fueron suministrados por Juncá Gelatinas

(Gerona, España) y Dow Chemical (USA) respectivamente. Lo natural

Los extractos utilizados en estos estudios fueron: perejil (Petroselinum sativum)

Y aceites esenciales de limón (Citrus limon) (Herbes del Molí,

Alicante, España); Naranja dulce (Citrus sinensis L. Osbeck) y amargo

Naranja (Citrus aurantium spp. Amara) EOs (Evesa, Cádiz, España);

Clavo de olor (Eugenia caryophyllata Thunb.), Romero (Rosmarinus officinalis

L.), tomillo (Thymus vulgaris L.) y oregano (Origanum vulgare L.) EO

(Soria natural, Soria, España); Sabroso de verano (Satureja hortensis) EO

(Biover, Bélgica); Romero y extractos de orégano (Condimentos

Sancan, Barcelona, ​​España) y extracto de cítricos (Agrobiosys, España). los

La selección se basó en la eficacia antimicrobiana

EO / extractos o propiedades sensoriales, seleccionando los que serían

Organolépticamente más adecuados para los productos alimenticios

pescado). El glicerol se adquirió de Panreac Química S.A.U.

(Barcelona, ​​España) y el carbonato de potasio fue suministrado por Probus

S.A. (Barcelona, ​​España).

En el caso de los medios de cultivo utilizados para los ensayos antimicrobianos, caldo de infusión de corazón cerebral (BHI) y bacteriológico europeo Agar se compraron a Pronadisa (Conda Laboratories, Madrid, España).

2.2. Cepas bacterianas

Las cepas utilizadas en este estudio fueron Listeria innocua CECT 910

Type Culture Collection) y P. fluorescens y A. hydrophila / caviae aislados

De dos especies de peces. El aislamiento de las bacterias se llevó a cabo

Desde dorada dorada (Sparus aurata) y lubina (Dicentrarchus

Labrax) envasados en bolsas de plástico y almacenados a temperatura refrigerada (4 ° C) durante una semana. Las muestras se empaquetaron con vacío parcial (presión mantenida 375 mbar). Después de ese período de tiempo, algunas colonias fueron seleccionadas y fueron identificadas por las galerías API (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) y otras pruebas bioquímicas. Las cepas se conservaron a -80 ° C en infusión de corazón de cerebro suplementada con glicerol estéril al 20% (p / v).

2.3. Preparación de suspensiones bacterianas

Antes de cada experimento, los cultivos madre descongelados (200 μl para

L. innocua y 100 μL para P. fluorescens y A. hydrophila / caviae) fueron

Se transfirieron a tubos que contenían 10 ml de BHI y se precultivaron al

37 ° C (L. innocua) ya 30 ° C (P. fluorescens y A. hydrophila / caviae)

Durante 24 h. Cada cepa bacteriana se inoculó entonces a 103 UFC / ml en BHI

Tubos y se cultivan en las mismas condiciones mencionadas anteriormente hasta

Fase de crecimiento estacionaria temprana (109 UFC / ml). El crecimiento estacionario

Se seleccionaron las células de fase única, ya que se ha informado que tienen mayor

Resistencia que las células de fase de crecimiento exponencial (Karatazas et al., 1999;

Koga et al., 1999). Todas las suspensiones bacterianas se diluyeron en BHI para

Finalmente obtener cultivos de aproximadamente 108 UFC / mL, que fueron posteriormente

Utilizados como inoculaciones en los ensayos antimicrobianos.

2.4. Ensayos antimicrobianos de extracto natural / aceites esenciales

Para los ensayos antimicrobianos, se diseminaron 100 μl de cada inóculo en

BHI (capa de agar de 4 mm de grosor). La actividad antimicrobiana

De diversos extractos naturales fue probado por métodos de difusión

Utilizando discos de papel de filtro estériles (6 mm de diámetro, Whatman nº 1) impregnados

Con 5 μl del extracto puro. Las pruebas se realizaron por

(Difusión en agar) y por difusión en fase de vapor. Negativo

Los controles se realizaron utilizando agua destilada estéril en lugar de compuestos activos.

Los diámetros de las zonas de inhibición fueron registrados y

Los valores se dieron como el promedio de tres repeticiones.

.4.1. Actividad antimicrobiana por método de difusión de disco

Se colocaron discos de papel impregnado sobre la superficie de los

Agar. Las placas de Petri se sellaron usando parafilm y se dejaron 1 h en

El gabinete de seguridad, con el fin de permitir la difusión del

compuestos. A continuación, las placas se incubaron a 37 ° para L. innocua y al

30 ° C para los aislamientos de P. fluorescens y A. hydrophila / caviae para

24 h. Se estimó la susceptibilidad de las bacterias a cada extracto

Midiendo los diámetros de las zonas de inhibición y restando

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