Estandarización de método espectrofotométrico

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1. INTRODUCCIÓN

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (materias primas, principios activos contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son relativamente sencillos. Usando esta técnica se puede cuantificar por diferentes metodologías como la curva de calibración, adición patrón y estándar interno entre otras. Se conocen como métodos espectrofotométricos y según sea la radiación utilizada como espectrofotometría de absorción visible (colorimetría), ultravioleta, infrarroja.

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Figura 1. Espectro electromagnético

1. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA

La absorción y emisión de luz por parte de las sustancias se origina en la estructura misma de las moléculas y de los átomos.  El tamaño, la forma, la flexibilidad de las moléculas, la distribución de los electrones en átomos y moléculas. La estructura de la sustancia, origina la especificidad en la radiación absorbida o emitida por ellas. Energía de las moléculas:

Etotal = Etranslación + Erotación + Evibración + Eelectrónica

Los movimientos de rotación, vibración y electrónico están sujetos a restricciones cuánticas significativas, o como se dice generalmente están cuantizados. Cuando una molécula absorbe o emite radiación debe variar su energía desde un valor permitido a otro. En espectroscopia se miden las energías de los cuantos que son absorbidos o emitidos por la molécula, a través de sus espectros, y se utiliza la información de los mismos, para deducir las energías permitidas de la molécula y hacer relaciones con la estructura molecular. En los estudios de sistemas moleculares, generalmente se emplea la ecuación de Edwin Schrödinger que permite obtener relaciones entre las propiedades moleculares y las energías que están permitidas para cualquier movimiento particular.

Los instrumentos para realizar medidas de absorción de luz por parte de las especies químicas, constan básicamente de los siguientes componentes:

• La fuente de luz que emite la radiación, que posteriormente interactúa con la muestra. Si irradia  luz  en  un  intervalo  amplio  de  longitudes  de  onda,  recibe  el  nombre  de  fuente continúa. Si irradia luz sólo en ciertas longitudes de onda específicas, recibe el nombre de fuente de líneas.
• Un sistema que permite separar bandas de luz estrechas, ya sea antes o después de la interacción  de  la  luz  con  la  muestra  o  sistema  monocromador,  constituido  por  lentes, espejos, redes de difracción, prismas de refracción, rendijas etc.
• Un compartimento para colocar la muestra en celdas o cubetas adecuadas, dependiendo de la región del espectro utilizada.
• Un  sistema  para  la  detección  de  la  radiación  que  ha  atravesado  la  muestra  o  sistema detector, cuyas características dependen de la zona del espectro utilizada. Si la señal lumínica es transformada en señal eléctrica el sistema recibe el nombre de transductor.
• Sistemas para la amplificación, transformación y comparación de la señal eléctrica para un registro posterior de ella.
• Sistemas de registro de la señal mediante movimiento de agujas o señales digitales o registro gráfico o mediante sistemas computarizados.

Actualmente los sistemas correspondientes a  la  fuente,  monocromador,  celda  y  detector  son llamados módulos característicos ya que su diseño, materiales ópticos y sus características dependen de la región del espectro que se esté utilizando. Los sistemas de amplificación, transformación, comparación de la señal y registro se llaman módulos procesadores y  presentan  características comunes sin importar la zona del espectro utilizado. Dependiendo de la zona del espectro en donde estemos trabajando tenemos diferentes respuestas en %T, Absorbancia de acuerdo a características de estructura, grupos cromóforos entre otras.

1. OBJETIVOS

General:

Elección, elaboración y ejecución de las estrategias lógico-matemáticas y experimentales para determinar la composición cualitativa y cuantitativa de una muestra por medio de la interacción entre la energía radiante y la materia en las diferentes regiones del espectro electromagnético.

Específicos:

• Identificar los componentes que integran un espectrofotómetro y su función correspondiente.
• Familiarizar al estudiante con el adecuado manejo del espectrofotómetro.
• Establecer algunos parámetros de validación y verificación de un espectrofotómetro Genesys y Jenway.

1. MATERIALES Y REACTIVOS

1. PRECAUCIONES

ANTES DE EMPEZAR LA PRÁCTICA ES IMPORTANTE: Tener claro el concepto de pureza, incertidumbre, exactitud, precisión y dilución. Reconocer y usar material aforado; es responsabilidad del docente aclarar dudas y verificar mediante quiz el trabajo de los estudiantes.

NO OLVIDE el uso de EPP (elementos de protección personal): gafas, guantes y bata. Revisar el manejo del equipo según especificaciones del docente.

1. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Reconocimiento del equipo

El equipo utilizado para esta práctica es un espectrofotómetro JENWAY 6405, preste atención al docente en la explicación sobre el manejo, los cuidados y el mantenimiento que debe llevarse a cabo para la utilización de este equipo y otros similares.

Preparación de soluciones

Solución stock

• Con el material de laboratorio adecuado prepare una solución patrón de 1000 ppm de dicromato de potasio (100 mL), esta servirá como solución stock. A partir de esta solución se prepararán las demás soluciones de trabajo (tenga en cuenta esto para definir el volumen final de solución stock a preparar), asegúrese de calcular la concentración de la solución stock con exactitud.
• Pese la cantidad previamente calculada de dicromato de potasio en un vidrio de reloj, disuelva el sólido con agua en un vaso de precipitados; transfiera cuantitativamente con la ayuda de la varilla de vidrio y el frasco lavador, el contenido del vaso al matraz y afore con agua hasta el volumen final, recuerde homogenizar muy bien la solución. Marque la solución final para evitar confusiones.

Soluciones de trabajo

• A partir de la solución stock y utilizando el material adecuado (balones aforados de 50 mL) realice las diluciones necesarias para tener soluciones de diferente concentración que se encuentren entre 10 ppm y 100 ppm, según sea la asignación de grupos por parte del docente. Marque de manera adecuada las soluciones y calcule con exactitud sus concentraciones.

Estandarización del método

Longitud de onda analítica

• El primer parámetro que se va a determinar es la longitud de onda analítica, para ello tome una de las soluciones de trabajo que se encuentre entre 40 y 60 ppm, realice un barrido en el espectrofotómetro entre los 200 y los 900 nm (recuerde que el blanco es agua), observe el espectro de la sustancia estudiada y defina la longitud de onda analítica, con este valor de λ realice los demás ensayos.

Linealidad y sensibilidad

• Según las indicaciones del docente, mida absorbancia o transmitancia, realice las lecturas en el espectrofotómetro de todas las soluciones de trabajo midiendo de menor a mayor concentración, para ello, lave la celda de cuarzo con agua (las celdas de cuarzo debido a la calidad del material tienen un costo alto, por lo tanto tenga mucha precaución al manipularlas) sosteniendo siempre la celda por las paredes esmeriladas, absorba con un pedazo de papel absorbente de manera muy delicada el agua que este sobre las paredes externas de la celda, y finalmente termine de limpiar la celda con ayuda de un papel de arroz. Vierta la solución de trabajo en la celda hasta la marca teniendo cuidado de no dejar burbujas dentro de la celda; la solución debe quedar totalmente translucida, si usted observa turbidez o sólidos en suspensión deseche la solución y prepare de nuevo.  
• Tenga en cuenta también la posición en la que introduce la celda al espectrofotómetro, por más homogéneo que sea el material las dos caras de la celda por donde atraviesa la luz, son diferentes, para evitar errores en la medición siempre coloque las celdas en la misma posición, ayúdese con las marcas que tiene la celda.

Precisión

• Existen tres parámetros que sirven para la medición de la precisión de un método durante la validación de una metodología o en la calificación de un instrumento: repetibilidad, precisión intermedia y reproducibilidad, en esta práctica solo se evaluarán dos de esos parámetros que servirán para tener un acercamiento a la evaluación de la precisión del método que se está estandarizando.

Repetibilidad

• Tome una de la soluciones de trabajo que haya tenido una absorbancia entre 0,4 y 0,6, con esta solución mida 10 veces la absorbancia (o la transmitancia) desocupando la celda y ajustando el blanco con agua, cada vez que vaya a realizar la medición.

Precisión intermedia

• Compare los resultados con un compañero de laboratorio que haya realizado 10 mediciones de absorbancia (o transmitancia) con la misma solución que usted utilizo en el numeral anterior.

Límite de detección y límite de cuantificación

• Lave muy bien la celda con agua destilada, y llénela con la solución que esté utilizando como blanco (en este caso agua destilada) limpie la celda y póngala dentro del espectrofotómetro, ajuste el cero de absorbancia (solo se ajusta una vez). Retire la celda, deseche el agua y vuelva a llenar la celda, repita la lectura del blanco 10 veces, sin ajustar el cero de absorbancia.

1. SEGÚN EL DESARROLLO EXPERIMENTAL REALICE LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES

• Realice un POE (Procedimiento Operativo Estándar) del funcionamiento y manejo del espectrofotómetro, según las indicaciones del docente. Debe incluir la manipulación de las celdas de cuarzo.
• Observe y analice el espectro obtenido del dicromato de potasio ¿Qué tuvo en cuenta para la selección de la longitud de onda analítica?
• Construya la curva de Ringbom y determine el intervalo lineal de la metodología utilizada.
• Según el intervalo lineal encontrado, construya la curva de calibración y de allí determine la ecuación de la recta que describe matemáticamente el comportamiento.
• Determine y analice la sensibilidad del método estudiado.
• Calcule y analice el límite de detección y el límite de cuantificación.
• Analice la precisión del método utilizando las herramientas estadísticas apropiadas.    

1. BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA

• HARVEY D. Química Analítica moderna. Ed. McGraw Hill. Madrid. 1202.
• HARRIS D. Análisis Químico Cuantitativo. Ed. Reverté. 2007.
• AGREDA J., Duarte M y Henao L., "Guía de laboratorio Química Analítica II", Universidad Nacional de Colombia- Dpto Química, Bogotá, 2000
• SKOOG D, Holler F, Nieman T. "Principios de análisis instrumental 5a ed". Madrid-España. McGraw-Hill. 2001

1. INTRODUCCIÓN

La colorimetría es una técnica instrumental que tiene por objeto determinar la absorción de luz visible por una muestra, la muestra puede ser una sustancia pura o bien una mezcla o disolución.

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