Extraccion DNA

I. INTRODUCCIÓN

El ácido desoxirribonucleico, es un ácido nucleico que contiene instrucciones

genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de los organismos vivos conocidos. El ADN lleva la información necesaria para dirigir la síntesis de proteínas y la replicación. Se llama síntesis de proteínas a la producción de las proteínas que necesita la célula o el virus para realizar sus actividades y desarrollarse.

La replicación es el conjunto de reacciones por medio de las cuales el ADN se copia a sí mismo cada vez que una célula o un virus se reproduce y transmite a la descendencia la información que contiene. En casi todos los organismos celulares el ADN está organizado en forma de cromosomas, situados en el núcleo de la célula.

Estructura del ADN

Cada molécula de ADN está constituida por dos cadenas o bandas formadas por un elevado número de compuestos químicos llamados nucleótidos. Estas cadenas forman una especie de escalera retorcida que se llama doble hélice. Cada nucleótido está formado por tres unidades: una molécula de azúcar llamada desoxirribosa, un grupo fosfato y uno de cuatro posibles compuestos nitrogenados llamados bases: adenina (abreviada como A), guanina (G), timina (T) y citosina (C).

La molécula de desoxirribosa ocupa el centro del nucleótido y está flanqueada por un grupo fosfato a un lado y una base al otro. El grupo fosfato está a su vez unido a la desoxirribosa del nucleótido adyacente de la cadena. Estas subunidades enlazadas desoxirribosa-fosfato forman los lados de la escalera; las bases están enfrentadas por parejas, mirando hacia el interior, y forman los travesaños.

Los nucleótidos de cada una de las dos cadenas que forman el ADN establecen una asociación específica con los correspondientes de la otra cadena. Debido a la afinidad química entre las bases, los nucleótidos que contienen adenina se acoplan siempre con los que contienen timina, y los que contienen citosina con los que contienen guanina. Las bases complementarias se unen entre sí por enlaces químicos débiles llamados enlaces de hidrógeno. 1)

III.- 4 Procedimiento.

Preparación de placas de agar LB.

Se suspendieron 10g del medio de cultivo en 0.25L de agua destilada, calentando a ebullición hasta su completa disolución. Se esteriliza en autoclave a 121°C y 15lb de presión durante 15 minutos. Se distribuyó en cajas Peri estériles.

Preparación de caldo LB.

Se suspendieron 12.5g de base de caldo en 0.5L de agua destilada hasta su disolución total, se distribuyó y esterilizó a 121°C 15 minutos.

Esterilización.

Se realizó en autoclave con exposición a 121°C durante 15 minutos. Con este método mueren las células vegetativas y endosporas.

Siembra de bacterias.

Se sembró una de las colonias en medio LB, incubando a 37°C toda la noche y con movimiento de 140-300rpm.

Recogida de células y lavados.

Se centrifugaron 10mL de cultivo a 10000rpm durante 10 minutos y se decantó el sobrenadante. 2)

Extracción de DNA con el kit Qiagen.

Primero se resuspendió el pellet bacteriano en 4mL de buffer P1, posteriormente se añadieron 4mL de buffer P2, agitando por inversión de 4 a 6 veces y se incubó a temperatura ambiente 5 minutos.

Se añadieron 4mL de buffer P3 y se mezcló por inversión de 4 a 6 veces y se incubó en hielo 5 minutos.

Se centrifugó entre 10000 y 13000 rpm 10 minutos y se extrajo el sobrenadante.

Se añadió un volumen igual al del sobrenadante de isopropanol para precipitar en DNA plasmídico, mezclando por inversión. Se centrifugo a 10000rpm durante 30 minutos y se decantó el sobrenadante con mucho cuidado.

El pellet se lava con 1mL de EtOH al 70% y se centrifuga a 10000rpm 10 minutos. Se decantó el sobrenadante y se dejó secar

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