Extraccion de DNA vegetal

Instituto Politécnico Nacional[pic 1][pic 2]

Escuela Nacional de R Biológicas

Alumnos: Carlos Antonio Lujan Torres, Jesús Bucio.

Grupo: 4QM1                          Sección: 4

Aislamiento del DNA de origen vegetal y su caracterización espectrofotométrica e identificación de bases púricas y pirimídicas por cromatografía en capa fina.

Objetivos:

• Aislar, purificar y caracterizar DNA de guayaba
• Separar las bases nitrogenadas del DNA y el RNA por cromatografía en capa fina a partir de hidrolizados de los mismos, identificándolas por la propiedad que tienen de absorber luz ultravioleta

Resultados:

• Se obtuvo DNA en forma de fibras, observables como precipitado en el solvente de cloroformo: alcohol isoamílico, esta es la estructura primaria de la molécula de DNA
• El espectro de absorción obtenido se construyó a partir

de los siguientes datos:

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De acuerdo a la fórmula para determinar la pureza de DNA en la muestra y concentración se obtuvieron los siguientes resultados:
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Si el cociente es de 2 se dice que la pureza es del 100%, como se obtuvo 1.3437 se realiza la relación:
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Para la determinación de concentración se hizo uso de:
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• La cromatografía en capa fina que nos permitió caracterizar las bases nitrogenadas presentes en DNA y RNA nos brindó los siguientes resultados que se grafican a escala de la cromatografía realizada:

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Discusión de resultados:

• El DNA obtenido se observó en forma de hebras o fibras suspendidas en una mezcla de cloroformo-alcohol isoamílico. Lo que se puede explicar dado el tratamiento que se le dio a la muestra de Guayaba. Éste tratamiento fue provocando una desnaturalización del DNA desde su estructura terciaría, donde el DNA está contenido en el núcleo y se encuentra súper enrollado asociado a proteínas llamadas histonas, que permiten este superenrollamiento en un espacio muy pequeño, hasta su estructura primaria, donde el DNA queda expuesto y pierde ese superenrollamiento, debido a que sus asociaciones con las proteínas se pierden.
  Durante el desarrollo de la técnica se hace uso de diferentes métodos para purificarla, el primero de ellos es el uso de la amilasa que degrada al polímeros de azúcar presente en la muestra vegetal, posteriormente también se realiza un salting out para precipital proteínas por medio de NaCl saturado, además de las centrifugaciones que nos permitieron separar en fases.
• En el espectro de absorción de DNA se observa una curva que tiene un máximo de absorción a los 210 nm, según la literatura consultada, el máximo de absorción de las bases nitrogenadas es cerca de los 260 nm, por lo que la región de lectura de estos compuestos debe ser a los alrededores. Nuestro espectro lo podemos dividir en zonas: la primera en la que nos enfocaremos será en el máximo de 210nm. A esta longitud de onda aquellos grupos que absorben son los grupos fosfato, si tenemos en mente que el DNA tiene expuestos los grupos fosfato hacia afuera de la cadena se puede explicar que a esta longitud de onda se presente un pico, que es alrededor de los 0,5 amstrongs; otra zona que se tiene que observar es aquella que ronda los 240 nm, a esta longitud absorben los enlacen peptídicos, que tienen un carácter de doble enlace, esta región nos puede dar indicio de qué tan contaminada puede estar nuestra muestra por proteínas; la región que ronda los 260nm, como se dijo anteriormente, es donde absorben las bases nitrogenadas características del DNA, en esta región observamos una pequeña elevación de la curva tipo, lo que nos sugiere la presencia de estos grupos en la muestra y dado también la presencia de fosfatos podemos sospechar que la molécula que buscábamos extraer sí está presente en nuestra muestra.
• Según los resultados obtenidos nuestra muestra presentó una pureza de DNA del 67%, si observamos en el espectro podemos sospechar que el resto se debe a proteínas, debido a que hay una absorción a 240nm relativamente grande, lo que indicaría la presencia de enlaces peptídicos, en menor cantidad también observamos, en 280nm la presencia de anillos aromáticos característicos de las proteínas, como triptófano o fenilalanina. Se podría hacer una prueba de Molish para comprobar si en la muestra tenemos carbohidratos que también forman parte del porcentaje de impurezas en la muestra, sin embargo, basados en la técnica podemos decir que nuestro rango de pureza en bueno ya que la técnica en general brinda purezas entre el 50% & 60%.
  Respecto a la concentración de DNA en nuestra muestra podemos decir que éste fue muy poco, adjudicamos este hecho a la muestra misma que presentaba algunos rasgos de inmadurez.
• El cromatograma utilizado nos permite comprobar la presencia de nucleótidos en los ácidos nucleicos y cuáles son esos nucleótidos. En primer lugar tenemos la muestra denominada DNA pool, esta muestra es una mezcla de sustancias estándares de nucleótidos de Citocina, Guanina, Adenina y Timina, cuando se pone a correr en la cromatografía contra soluciones estándares de nucleótidos observamos la similitud de Rf en 4 de ellos, estos son Citocina, Guanina, Adenina y Timina. Lo que nos comprueba que en las cadenas de DNA están presentes estos nucleótidos, el corrimiento con un hidrolizado de DNA refuerza nuestra tesis, ya que los Rf en este caso también coinciden.
  La otra muestra analizada fue la muestra de RNA en donde observamos la presencia de 4 manchas, al calcular los Rf notamos que estos coinciden con 3 de los presentes en la muestra de DNA, estos son Adenina, Guanina y Citocina, sin embargo notamos una diferencia respecto a uno de ellos, anticipando esta situación, junto a las soluciones estándares antes mencionadas se puso a correr también una solución estándar de uracilo, que coincide con la otra mancha en el carril correspondiente al RNA.

Conclusiones:

• El DNA se encuentra formado por cuatro clases de nucléotidos llamados Adenina, Guanina, Citocina y Timina.
• El RNA se encuentra formado por cuatro clases de nucleótidos llamados Adenina, Guanina, Citocina y Uracilo.
• La técnica utilizada para la obtención de DNA es poco eficiente cuantitativamente hablando, pero es bastante sencilla desde el punto de vista operativo.
• Las regiones de absorbancia en el espectro son importantes para identificar las moléculas presentes en la muestra, notamos que una absorbancia en una región refuerza nuestra tesis cuando se compara con la absorbancia en otra región.

Bibliografía:

• Nelson D.L., Cox M.M., “Leninger Principios de Bioquímica”. Editorial OMEGA, 3° edición, pp: 527-544. (2007).
• Conn E.E., Stump P.K., Bioening G., Dor R.H., “Bioquimica Fundamental”, editorial Limusa Witeg S.A., 4° edición, pp: 417-420 (2004).

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