EXTRACCION DNA GENOMICO DE BACTERIAS

EXTRACCION DNA GENOMICO DE BACTERIAS

Abraham Guerra 1 & Danny Parra1

1Estudiantes del Programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas, Universidad del Atlántico Km 7 Antigua vía Puerto Colombia

Abrahamguerra20@hotmail.com

Resumen:

Partiendo de los conocimientos que se lograron desbordar de los laboratorios realizados los días 4, 6 y 18 de junio 2019, realizamos la extracción del DNA un cultivo bacteriano, usando una combinación métodos físicos, químicos y enzimáticos, como ARNasa, TAE, EDTA, entre otros; Y una vez obtenido el ‘’DNA puro’’ se efectuó espectrofotometría y electroforesis con el fin de determinar la concertación y pureza de DNA, y por consiguiente determinar si el material genético obtenido es apto para otras prácticas genéticas como la PCR.

Palabras claves: DNA, Lisis celular, Electroforesis.

Introducción

La obtención de muestras de DNA representa la base de muchas técnicas que se realizan en la biología celular y otras áreas cercanas. Es por ello por lo que se hace uso de métodos de extracción y purificación del DNA específicas para cada tipo de célula, para así poder obtener el material genético lo más puro posible debido al gran amplio espectro de organismos de las cuales se puede realizar esta extracción. La extracción de DNA se efectúa con el objetivo de obtener moléculas de ácidos nucleidos aisladas con alto grado de pureza y para ello el método a utilizar debe cumplir con unos criterios básicos como la extracción y obtención de una cantidad grande de DNA puro libre de contaminantes como proteínas, lípidos, entre otros. Por lo regular, para conseguir dichos criterios básicos los métodos utilizados siguen un lineamiento muy específico y universal, el cual inicia con la lisis celular por medio de la utilización rupturas mecánicas o químicas, e incluso combinaciones de ellas; y seguido a esto se desnaturalizan las proteínas y se eliminan el resto de los contenidos orgánicas para poder conseguir la muestra de material genético purificado [1].

Metodología

Con base a la guía que proporcionada por el profesor y teniendo en cuenta algunas modificaciones que el mismo realizo por seguridad, iniciamos la extracción de DNA el 4 de junio, agregando 1500ul del cultivo bacteriano a un tubo eppendorf, el cual se llevó a centrifugar por 5 minutos a 13000 rpm. Posterior a ella, se retiró el sobrenadante y al mismo se le agregaron 200ul de amortiguador de lisis, y seguidamente se centrifugo el tubo nuevamente durante 5 minutos a 13000rpm, y luego el sobrenadante obtenido después de la centrifugación, fue descartado. Después se agregaron 200ul de solución de lisis celular al tubo que únicamente contenía el pellet, y este fue llevado a baño maría durante 10 minutos a 65°C. Pasados los 10 minutos, el tubo fue llevado a centrifugar durante 10 minutos a 13000rpmy una vez finalizada la centrifugación, el sobrenadante fue descartado. Al tubo se le agregaron 100ul de la solución de precipitación de proteína, la cual se invirtió varias veces el tubo hasta ver una solución blancuzca, y luego a eso se llevó a centrifugar durante 4 minutos a 13000rpm. Con la ayuda de una micropipeta se tomó el sobrenadante y se llevó a otro tubo eppendorf, al cual se le agregaron posteriormente 400ul de etanol absoluto frio y se llevó al refrigerador hasta la siguiente práctica. El jueves 6 de junio se tomó el tubo, y llevo a baño maría durante 15 minutos a 65°C. Posteriormente se agregó la misma cantidad de etanol ya mencionada, y luego se centrifugó durante 5 minutos a 13000rpm. Posterior a ella, se descartó el sobrenadante y el tubo se secó por 5 minutos en un papel absorbente de forma invertida. Mas tarde, se le agregaron 500ul de TEA (solución de rehidratación) y estos fueron almacenados en un refrigerador en nuestras casas hasta la siguiente semana a continuar la práctica. Para finalizar la práctica, el 18 de junio se hidrato el ADN con 100ul De tris-EDTA (Buffer) y luego se llevó a baño maría durante 15 minutos a 65°C. Posteriormente al baño de maría, se tomaron 50ul del DNA con una micropipeta y se llevaron a otro tubo eppendorf, el cual fue resuspendido con 1450ul del buffer TBE1X. Para la cuantificación del DNA por medio de espectrofotometría, se tomaron 500ul de la dilución preparada (buffer TBE1X + DNA) y se llevaron a una cubeta de cuarzo en el espectrofotómetro el cual fue ajustado a una longitud de onda de 260nm y 280nm respectivamente.  Para la electroforesis, preparamos el gel de agarosa a partir de 50ml del buffer TEB1X y 0,8g de gel agarosa, los cuales fueron calentados hasta homogeneidad y posteriormente fueron depositados en un molde a el cual incrustamos dos placas que al solidificarse el gel permitieron obtener los pozos donde se llevó el DNA y los marcadores moleculares. Una vez obtuvimos los pozos, depositamos 5ul del marcador moléculas en dos de los pozos, y el resto de ellos fue depositado con una muestra de 10ul de DNA en conjunto del colorante naranja. Seguidamente, comprobamos que el polo negativo coincidiera con el lado donde habían sido depositado las muestras de DNA y posterior a esto, activamos la corriente para la iniciaciones de la electroforesis.

Resultados

Tabla 1. Absorbancia y concentración del DNA.

[pic 4]

Imagen 1. Electroforesis en gel agarosa.

Discusión

El resultado de la espectrofotometría fue con base a los datos que nos dio en la absorbancia de 260nm y la de 280nm podríamos sacar la pureza o la impureza del DNA, dividiendo 0,116(260nm) entre 0,102(280nm) nos da como resultado 0,137. Esto quiere decir que el DNA de nosotros esta impuro ya que en la guía dice que debe estar igual o por encima de 1,7para ser puro.

Bibliografía

[1] Carbajal, A. (2019). Extracción y purificación de ADN. http://www.labome.es/method/DNA-Extraction-and-Purification.html

[2] Solomon, E., Berg, L. y Martin, D. (2001). Biología. (5ª. ed.). México: McGraw-Hill Interamericana.

[3] Cheng, HR. & Jiang, N. Biotechnol Lett (2006) 28: 55. https://doi.org/10.1007/s10529-005-4688-z

[4] Charles S. Hoffman, Fred Winston, A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformaion of Escherichia coli, Gene, Volume 57, Issues 2–3, 1987, Pages 267-272, ISSN 0378-1119, https://doi.org/10.1016/03781119(87)90131-4. (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0378111987901314)

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