Procedimeinto de extracción de DNA y RNA

1.- Rompimiento celular: El primer paso para la extracción de DNA es la lisis de la célula a la cual le vamos a extraer el DNA. Este puede ser por métodos mecánicos, como puede ser con ayuda de nitrógeno líquido y un mortero, y métodos no mecánicos, estos son detergentes o enzimas como la lisozima. Este proceso nos va a servir para llegar al material genetico de la célula.

2.- Inhibir la acción de las nucleasas: Este paso se hace mediante la suspensión de la muestra en buffer. Lo que va a provocar que la acción de las nucleasas se inhiba, las nucleasas son enzimas específicas que catalizan la hidrolisis de los enlaces fosfodiéster que unen la cadena de nucleótidos. Haciendo que se rompa la cadena de nucleótidos en el DNA y RNA.

El buffer para ocupar para detener la acción de las nucleasas son el EDTA. Este buffer ejerce su función ya que desprotona el ion magnesio, ya que es una molécula quelante. Entonces a desprotonar el ion magnesio este ya no le sirve como cofactor a la nucleasa por lo que no va a ejercer su acción.

3.- Digestión de lípidos y proteínas: Esto se va a lograr mediante la solubilización de la muestra. Este proceso se hace antes de precipitar el material genetico, ya que, si no se hace, el material genetico va a precipitar con estas impurezas, lo que va a afectar a la muestra.

Ahora se pueden usar dos formas más clásicas:

• Con SDS: Este procedimiento se basa en la formación de micelas con las proteínas y lípidos que están en el núcleo. Este detergente (SDS) hace que se formen micelas, solo al agregarle SDS la concentración micelar critica va a hacer muy alta por lo cual no va a existir la precipitación, por lo mismo se va a agregar acetato de potasio o acetato de amonio. Esta combinación de acetato de potasio o acetato de amonio + SDS la concentración micelar critica se va a reducir lo suficiente para que las micelas de proteínas y lípidos precipiten.
• Con FENOL: Por otro lado, existe el procedimiento con FENOL. Este se basa en formar 2 fases en la muestra, y una fase intermedia. Estas fases son la fase acuosa y la fase orgánica. El procedimiento parte con agregar la misma cantidad de FENOL que la muestra, y posteriormente se va a hacer un procedimiento de centrifugación. Aquí es donde se van a formar 2 fases son la fase acuosa y la fase orgánica, y una fase intermedia en donde se van a quedar proteínas de membrana y nucleasas, mientras que en la fase orgánica estará compuesta de LIPIDOS Y EL FENOL AGREGADO, ya que el fenol no es soluble. En donde tenemos que enfocarnos es en la FASE ACUOSA en donde van a quedar el DNA y RNA.

• Cosas para tener en cuenta:

• Si se utiliza un fenol con pH acido, va a hacer que el pH baje en la solución. Esto va a provocar que el DNA pase a la fase orgánica, junto los lípidos y el fenol. Dejando al RNA solo en la fase acuosa. Para que esto no pase se tiene que usar un FENOL ALCALINO (básico). Lo que va a dejar al DNA en la fase acuosa junto al RNA y algunas proteínas. Estas proteínas restantes pueden ser eliminadas con enzimas proteasas. La más común es la proteasa K. Cabe destacar que al usar las proteasas se tiene que volver a hacer el procedimiento con el FENOL.

4.- Eliminación de RNA: Este es un paso sencillo. En donde la muestra rescatada de la fase liquida del paso anterior, que contiene el DNA y el RNA, se le agrega pequeñas cantidades de enzimas degradadoras de RNA, estas enzimas se denominan RNAsas. Anteriormente de agregar las RNAsas se tiene que agregar inhibidores de RNAsas para después eliminarlas.

5.- Precipitación del DNA: Esto se va a logar creando un volumen de DNA. Esto se va a lograr haciendo bajar la capacidad de solvatar (ser solvente) del DNA. Se ocupa como antecedente que el DNA es ácido. Entonces se cómo procedimiento se debe ocupar un ION O CONTRAION, para aumentar su cantidad de sales, generalmente se va a ocupar el ACIDO SALICILICO. Este acido salicílico se tiene que mezclar con un componente soluble en agua, y que tenga una constante DIELECTRICA menor. Generalmente se ocupan alcoholes como lo pueden ser el ETANOL o el ISOPROPANOL.

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