Genetica.

5.- ¿Qué es lo que usted afirma que sucedió en su trabajo en el laboratorio?

La primera parte fue hacer a una cepa de E. coli competente, esto con el fin de poder introducir ADN recombinante a su genoma. El primer paso para hacerla competente fue darle un tratamiento usando iones de calcio y un choque térmico a 42oC, una vez ocurrido esto se introdujo el plásmido seleccionando con anterioridad por transformación.

Ya que se introdujo el plásmido de forma correcta fue posible que esta cepa creciera en un medio de Luria con Kanamicina, por otro lado al sembrar el control hubo contaminación por parte del compañero que lo sembró ya que las bacterias usadas solo eran competentes pero no tuvieron contacto con el plásmido.

La segunda parte consistió en elegir una colonia que pudo desarrollarse en el medio Luria con kanamicina e inocular un medio líquido con el mismo antibiótico.

Posteriormente se utilizo solución GTE para debilitar la cubierta celular y se liso la célula con ayuda de NaOH y SDS, una vez que se obtuvo esto, se con ayuda del acetato de potasio el ADN plasmidico se re naturaliza, posteriormente se precipito el ADN cromosómico junto con el SDS, proteínas y lípidos con ayuda de etanol o isopropanol se remueven las trazas de sal que pudieron quedar.

Una vez que se obtuvo el plásmido se puede cortar usando enzimas de restricción y correr el plásmido en electroforesis en un gel de agarosa. Pero no obtuvimos ningún resultado en este paso, probablemente el plásmido se perdió en un punto previo o se evaporo al no mantenerlo en las condiciones adecuadas.

6.- ¿Cómo se lo que creo saber?

Usamos una cepa de E. coli especial, ya que esta cepa tiene mutadas las enzimas de restricción, con esto es posible introducir ADN ajeno a esta bacteria.

La técnica que usamos para poder hacer a E. coli competente se basa en que al crecer las bacterias y enfriarlas en iones calcio y posteriormente tratarlas con un choque térmico, se forman poros haciendo posible el ingreso del material genético al interior.

Esta cepa en particular no es resistente a kanamicina por lo que si el plásmido se incorporo le daría una nueva resistencia a kanamicina haciendo posible que creciera en el medio Luria con kanamicina, por otro lado en el control solo se usaron células competentes sin el plásmido, pero se obtuvo crecimiento, probablemente debido a que la compañera que sembró el control se reporto enferma es día y no tuvo el cuidado correcto para prevenir que se contaminar el cultivo control.

La segunda etapa se basa en lisar la bacteria para que esta libere el DNA plasmidico, la solución de GTE se compone de glucosa para mantener la presión osmótica, tris para amortiguar las células a pH de 8, EDTA el cual es un quelatante de iones de calcio y magnesio, al hacer esto se unen los cationes divalentes en la bicapa lipidica.

La solución de NaOH con SDS sirve para romper la pared celular de peptidoglicano y con ayuda del acetato de potasio el pH se neutraliza y los iones de potasio evitan la repulsión de los fosfatos de las hebras de ADN ayudando a su re naturalización.

El ADN genómico al ser muy grande se fragmenta y al desnaturalizarse sus

...