INFLUENCIA DE LA LIMITACIÓN EXTERNA DE LA TRANSFERENCIA DE MASA

INFLUENCIA DE LA LIMITACIÓN EXTERNA DE LA TRANSFERENCIA DE MASA SOBRE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS APARENTES DE LA PENICILINA G ACYLASE INMOVILIZADA SOBRE PARTÍCULAS DE SÍLICE ULTRAFINA NO PEROROSAS

La inmovilización de enzimas en soportes no porosos proporciona un modelo adecuado para investigar el efecto de la limitación de transferencia de masa externa sobre la velocidad de reacción en ausencia de resistencia difusional interna. En este estudio, la desacilación de penicilina G se investigó utilizando penicilina-acilasa inmovilizada sobre partículas de sílice ultra fina. Los estudios cinéticos se realizaron dentro de la región de baja concentración de sustrato, donde la limitación de transferencia de masa externa se hace significativa. Para predecir los parámetros cinéticos aparentes y el factor de eficacia global, es necesario conocer el coeficiente de transferencia de masa externa, kLu. Aunque existen varias correlaciones para la estimación de & Q, en este estudio se utilizó un esquema de optimización para obtener este coeficiente. Usando los valores óptimos de k, a, se pronosticaron las velocidades de reacción iniciales y se encontró que estaban en buen acuerdo con los datos experimentales.

Las enzimas inmovilizadas son de gran importancia tecnológica y científica. Para desarrollar el diseño del reactor para los sistemas catalíticos enzimáticos inmovilizados, es importante examinar con cierto detalle las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas. En general, la velocidad de reacción máxima y la constante de Michaelis determinada para una enzima inmovilizada son diferentes de los parámetros cinéticos evaluados desde su estado libre. Estos parámetros cinéticos pueden verse afectados por una serie de factores que incluyen la interacción entre la enzima y el soporte, el impedimento estérico y los fenómenos difusivos y electrostáticos, que sirven para alterar las concentraciones de sustratos y otras especies en el sitio de acción enzimática de los valores de la solución a granel -6). Los parámetros cinéticos definidos para los sistemas enzimáticos inmovilizados se denominan parámetros intrínsecos en ausencia de limitación de la transferencia de masa. Los parámetros cinéticos aparentes son los observados en presencia de limitaciones de transferencia de masa. Desafortunadamente, se ha llevado a cabo mucho menos trabajo en la obtención de parámetros cinéticos intrínsecos para sistemas enzimáticos inmovilizados. Por otra parte, debido a la desnaturalización de la proteína enzimática ya la interacción entre la enzima y el soporte, es muy difícil comparar los parámetros cinéticos de un sistema enzimático inmovilizado con los de su estado libre (1,2, 5-7 ). Los efectos combinados de la resistencia difusiva, el campo electrostático y la dependencia del sustrato sobre la velocidad de la reacción catalizada por una enzima inmovilizada sobre soportes porosos y no porosos han sido reportados (8). Además, se han obtenido también ecuaciones para parámetros cinéticos aparentes para una enzima inmovilizada sobre un soporte cerámico poroso (9). En el presente trabajo se investigó la aplicabilidad de las ecuaciones propuestas para los parámetros cinéticos aparentes utilizando los datos experimentales obtenidos para la penicilina G acilasa inmovilizada sobre partículas de sílice ultratina no porosas. Para este propósito, se midieron las velocidades de reacción iniciales para una amplia gama de concentraciones iniciales de sustrato. La veriticación de las ecuaciones propuestas se realizó utilizando los datos experimentales a concentraciones de sustrato suficientemente bajas, donde se puede usar la ecuación de Michaelis-Menten (1 O-13).

ANTECEDENTES TEÓRICOS

Se reconoce generalmente que la penicilina G acilasa es inhibida por una alta concentración de sustrato y puesto que la formación del producto es despreciable en la etapa inicial de la reacción, se ha sugerido el siguiente modelo para su comportamiento cinético (14):

[pic 1]

Donde S, es la concentración en masa del sustrato, V ,,, es la velocidad de reacción máxima, K, es la constante de Michaelis y K, es la constante de inhibición del sustrato. Cuando la enzima se inmoviliza sobre una superficie fija, la concentración del sustrato en la superficie puede ser diferente de la de la fase fluida a granel debido a la resistencia a la transferencia de masa externa e interna ya los efectos electrostáticos. En ausencia de estas limitaciones, la velocidad de reacción se puede expresar mediante la Ec. 1. Sin embargo, en presencia de efectos difusionales y electrostáticos, la introducción de un factor de efectividad puede modificar la velocidad de reacción real como sigue:

[pic 2]

Aquí, las constantes cinéticas V ,, y Km se llaman parámetros cinéticos intrínsecos. La ecuación anterior puede reordenarse de la forma siguiente:

[pic 3]

Se ha demostrado que una alta concentración de penicilina G es un ligero inhibidor de la penicilina G acilasa y el valor de la constante de inhibición del sustrato es dos órdenes de magnitud mayor que S ,, de modo que el término $ en la ecuación anterior puede ser descuidado A una concentración de sustrato suficientemente baja (1 O - 13). Al descuidar el término de inhibición del sustrato, la ecuación anterior se reduce a:

[pic 4]

Que se conoce generalmente como la ecuación de Michaelis-Menten. Se han investigado los efectos combinados de la resistencia difusiva externa y del campo electrostático sobre la velocidad de reacción catalizada por una enzima inmovilizada sobre una superficie no porosa, que sigue una cinética irreversible de Michaelis-Menten y se derivó la siguiente expresión para el cálculo del factor de efectividad 5,6, 8, 15):

[pic 5]

Donde

[pic 6]

La ecuación 5 muestra que para una enzima inmovilizada en superficie, el factor de efectividad es una función de la concentración adimensional sb del sustrato y, = K, superficie adimensional x y el módulo Thiele (pE = Kl Mk K, donde Mis La m la electrostática Modificador y kLa es el coeficiente de transferencia de masa externa La diferenciación de la ecuación 5 con respecto a p ,, conduce a la siguiente ecuación:

[pic 7]

Ef yf se emplean para calcular los parámetros cinéticos aparentes b. En presencia de resistencias difusionales y efecto de Sb electrostático, la relación entre v y S ,, se convierte en no lineal (l-3). Por simplicidad, Vim y K? Se definen como los parámetros cinéticos aparentes y la Ec. 4 puede ser reescrito como Eq. 9.

[pic 8]

Estos parámetros cinéticos aparentes se pueden calcular a partir de líneas tangentes a la gráfica no lineal de $ -Sb (8, 9, 15).

[pic 9]

Aquí, yyy2 son parámetros adimensionales que representan las desviaciones de los valores aparentes de la velocidad de reacción máxima y la constante de Michaelis de sus valores intrínsecos. Las sustituciones de la ecuación 5 y 8 en las ecuaciones 10 y 11 resultan en las ecuaciones 12 y 13, respectivamente.

[pic 10]

En el presente trabajo, se investigó la aplicación de las ecuaciones anteriores para la enzima inmovilizada en la superficie en ausencia de los efectos electrostáticos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Productos Químicos La penicilina G potásica (PGK) se adquirió de Jaber Iben-e-Hayan Pharmaceutical Co. (Teherán, Irán). Las partículas de sílice de ultratina no porosas (Snowtex 30,30,4% en peso) eran un regalo de la Universidad de Kobe (Kobe) y tenían un diámetro medio de 15 nm (16, 17). Todos los productos químicos utilizados fueron de grado analítico. Producción de penicilina G acilasa y su purificación parcial Se cultivó Escherichia coli (E. cob) ATCC 1 I 105 en un medio de cultivo que constaba de: ácido fenilacético 0,2% (p / v), extracto de ternero 0,5% (p / v) . NHXI 0. I% (p / v \, KH, HPO, 0,1% (p / v> .i (H, PO, 0,01% (wiv), hgSi), 7H, O 6,026 (k / v). Se dispusieron alícuotas (100 ml) del medio de cultivo en matraces cónicos de 500 ml con tapas de pelusa y se esterilizaron a 12 1 ◦ C durante 20 minutos Los matraces se inocularon con E. coli y Se incubaron en un agitador rotatorio (220 rpm) a 24 ° C durante 46 h.Las células se cosecharon por centrifugación, se lavaron y se incubaron en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,80). Posteriormente, las células se rompieron usando un ultrasonizador Bondlin-HD200 al La disolución de la enzima se purificó parcialmente usando una sal de sulfato de amonio y la fracción precipitó entre el 30% y el 60% de la saturación de sulfato de amonio Se recogió por centrifugación (14.000 xg, 40 min, 0_4 "C), se disolvió en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,80), y se dializó contra el mismo tampón.No se detectó actividad de penicilinasa en la parte p Enzima urificada. Inmovilización enzimática Se mezcló una solución enzimática (4 ml) de la concentración deseada (0,446 mg / ml, que se optimizó en otra investigación) con un volumen igual de suspensión de partículas de sílice ultrafinas, y 0,1 ml de solución de glutaraldehído (1%), A esta mezcla (I 6, 17). La inmovilización se llevó a cabo, en presencia de ácido fenilacético como inhibidor competitivo de la penicilina G acilasa para proteger el sitio activo, durante 2 h a 30 ° C (IO-I2). Las partıculas ultrafinas covalentemente reticuladas a la enzima se recuperaron luego por centrifugación (14.000 xg, 40 min, 04OC). Estas moléculas de enzima inmovilizadas se lavaron y resuspendieron en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 7,50) y se usaron para estudios cinéticos. En todos los experimentos, el área superficial de las partıculas utilizadas por unidad de volumen de la mezcla de reacción era de 1 μl / m. Condiciones del reactor y determinación de la velocidad de reacción Un diagrama esquemático del reactor utilizado para la medición inicial de la velocidad se presenta en la Fig. 1. Se prepararon alícuotas de 20 ml de soluciones acuosas de PGK en tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH = 8,00) a diferentes concentraciones y se iniciaron las reacciones mediante la adición de una cantidad apropiada de la enzima inmovilizada, para conseguir un tiempo lineal Para el consumo de PGK durante los primeros 15 minutos de la reacción. La velocidad de agitación para todos los experimentos fue de 170 rpm, que resultó ser la velocidad de agitación óptima en una investigación previa. Las velocidades de reacción enzimáticas iniciales se midieron mediante un método pH-stat. Este método se basa en la valoración del ácido fenilacético formado durante la hidrólisis del PGK por amoníaco. La velocidad de reacción inicial se calculó a partir de la pendiente del curso del tiempo de consumo de amoníaco en el momento de la reacción (IO, 1I). Todos los datos informados fueron valores medios obtenidos a partir de tres experimentos repetidos.

...