Informe: Genetica bacteriana

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           Unidad 5:

    Genética Bacteriana

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1. Ensayo de mutación: aislamiento de mutantes

Materiales

• 1 cultivo en caldo Tripticasa ( S. aureus)
•  1 agar Tripticasa con rifampicina
• 1 placa estéril
• 2 tubos con 10 ml de agar Tripticasa solución de rifampicina con rifampicina en gradiente
•  tubos eppendorf
•  micropipetas y puntas amarillas
• Set de antibióticos: Rifampicina (30mcg), Kanamicina (30mcg), Cloxacilina (5mcg), Acido nalidíxico (30mcg), Tetraciclina (30mcg), Ampicilina (10mcg)

Procedimiento:

Se tiene una cepa de Staphylococcus aureus en caldo de cultivo Tripticasa. A partir de este se prepara un inoculo (hasta conseguir la primera turbidez) en 2 ml de agua estéril, luego se agita y con tórula estéril se siembra sobre agar tripticasa. Se evalúa la resistencia contra un set de antibióticos: rifampicina, ácido nalidíxico, cloxacilina, ampicilina, kanamicina y  tetraciclina (1).  A continuación, se tomo con tórula una muestra del caldo de cultivo inicial (que contiene aproximadamente entre 108-109 bacterias), y mediante tórula se sembró sobre una placa de agar tripticasa con rifampicina 50μg/mL (2). Ambas placas se incuban en estufa a 37°C durante 24 horas. Una vez obtenido el crecimiento de colonias en el agar con rifampicina 50μg/mL, se realiza antibiograma para una de las colonias aisladas, en agar Müller-Hinton, contra los antibióticos: rifampicina, ácido nalidíxico, cloxacilina, ampicilina, kanamicina y  tetraciclina, de la misma forma en que se realizó para la cepa original.

Posteriormente se procede a realizar la preparación de un agar tripticasa en gradiente de rifampicina. Se agregan 8mL de agar tripticasa que contiene solución de rifampicina, a una placa la cual se deja levemente inclinada, y se espera que solidifique, una vez ocurre esto, se procede a agregar agar tripticasa fundido sobre el ya solidificado. Esta vez la placa se deja de manera horizontal. Una vez solidificado se siembran 100µL de la muestra inicial, con asa de vidrio. Se incuba a 37ºC por 24-48 horas (3).

Esquema [pic 5][pic 6]

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Resultados

En la placa con Rifampicina 50μg/mL se contaron 4 colonias, con borde regular, grisáceas, tamaño medio.

Los resultados obtenidos para el antibiograma de la cepa original y la cepa mutante se detallan en la siguiente tabla:

En donde la cepa original solo dio una resistencia para Ac. Nalidixico. Y la cepa mutante dio resistencia para Ac. Nalidixico y Rifampicina.

Comentario: se realizó primeramente un antibiograma para la cepa original y la selección de mutantes resistentes a rifampicina; siendo 4 colonias que crecieron en la placa con rifampicina 50ug/ml. Por otro lado, en la placa con gradiente de rifampicina no crecieron colonias, se cree que fue un problema de trabajo ya que si crecieron colonias en la placa de 50 ng/ml con mayor razón deberían crecer en esta placa, por lo tanto, se cree que no se sembró el inoculo. En consecuencia, no se pudo hacer un antibiograma.

Las bacterias aisladas desde la placa con rifampicina 50ug/ml, sí presentan resistencia a este antibiótico cuando se les realizó el antibiograma, una característica que no presentó la cepa original. La frecuencia de mutación a rifampicina(1.1x10-7) es considerada alta al ser comparada con la resistencia a otros antibióticos.

1. Ensayo de conjugación

Esquema del procedimiento:

Las cepas a ensayar corresponden a Escherichiacoli FT17 (cepa dadora) y E. coli K12 (cepa receptora). En un matraz que contiene 10 mL de caldo tripticasa estéril se colocan 0,5 mL de la cepa FT17 y 4,5 mL de K12. Se incuba a 35°C durante 15 minutos en la estufa.

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Luego, se realizan diluciones hasta 1/100, colocando primero 1 mL del caldo en 9 mL de agua estéril, y de ahí se toma 1 mL y se vuelven a colocar en 9 mL de agua estéril , dilución final de 1/100. Es de esta dilución que se toman 0,1 mL y se siembran con rastrillo sobre agar McConkey (MC) , 0,1 mL sobre agar McConkey + Ácido nalidíxico + Tetraciclina, y 0,1 mL sobre agar McConkey + Ácido nalidíxico + Ampicilina. Se lleva a incubar durante 24 horas a 37°C.

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En conjunto con esto, se realiza el antibiograma para ambas cepas y se siembran en agar McConkey. Se colocan entre 3 y 4 gotas en 2 mL de agua estéril, hasta lograr la primera turbidez. Se siembra con tórula estéril 100 uLsobre agar tripticasay se evalúan los antibióticos: Ácido nalidíxico, Kanamicina, Tetraciclina y Ampicilina. Esto se realiza tanto para la cepa de E. coli FT17 como para E. coli K12 y ambas placas se incuban a 37°C durante 24 horas.

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