LABORATORIO DE QUÍMICA INSTRUMENTAL.

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE QUÍMICA E ING. QUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

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Ciudad Universitaria.

                2014

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC)

Marco teórico:

La cromatografía liquida de alta eficacia (HPLC) es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada en la actualidad debido a su sensibilidad, a su adecuación para realizar determinaciones cuantitativas exactas y a su gran aplicabilidad a diferentes tipos de sustancias (aminoácidos, proteínas, acidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, plaguicidas, antibioticos, especies organometalicos y sustancias inorgánicas).

En principio se utilizó una alta presión para incrementar la velocidad lineal y reducir la difusión de los compuestos en el interior de las columnas empaquetadas, mejorando así la resolución de la cromatografía. Se emplearon para ello bombas capaces de generar hasta 500 psi, y la técnica de cromatografía líquida recibió el nombre de high-pressure liquid chromatography (cromatografía líquida de alta presión). En la década de los 70 la tecnología empleada experimentó grandes avances, con bombas capaces de generar hasta 6000 psi, mejores inyectores y detectores y columnas con partículas más pequeñas, en ese momento se mantuvo el acrónimo de HPLC pero el nombre pasó a ser high-performance liquid chromatography (cromatografía líquida de alta eficacia). En la actualidad para incrementar la resolución, la velocidad y la sensibilidad en la cromatografía líquida se han introducido columnas con partículas más pequeñas e instrumentos adecuados para bombear la fase móvil a presiones del orden de 15000 psi, o incluso 100000 psi, recibiendo esta tecnología el nombre de UPLC, ultra-performance liquid chromatography (cromatografía líquida de ultra eficacia)

Componentes de un sistema de HPLC.

Sistemas de bombeo:

Un sistema de bombeo de HPLC debe ser capaz de generar elevadas presiones, producir un flujo libre de pulsaciones, conseguir un amplio intervalo de caudales con elevada reproducibilidad y estar dotado de componentes resistentes a la corrosión.  

Las bombas empleadas pueden ser de distintos tipos, siendo las más comunes las recíprocas, las de desplazamiento y las neumáticas.

Las bombas recíprocas consisten en una cámara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor de arrastre. El flujo de disolvente hacia dentro y hacia fuera del sistema es controlado por dos válvulas de cierre de bola, que se abren y se cierran alternativamente. Con este diseño el disolvente estaría en contacto directo con el pistón. Otra posibilidad es comunicar al disolvente la presión a través de un diafragma flexible, que se bombea a su vez hidráulicamente por un pistón de vaivén. Una desventaja de las bombas recíprocas sería el flujo pulsado que producen; este problema se puede solucionar utilizando bombas con dos pistones que al trabajar alternativamente consiguen un flujo constante. Las ventajas de las bombas recíprocas son múltiples: su pequeño volumen interno, sus altas presiones de salida, su fácil adaptación a los gradientes y sus caudales constantes, prácticamente independientes de la columna y de la viscosidad del disolvente.

Las bombas de desplazamiento consisten en grandes cámaras similares a  jeringas, dotadas de un émbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. El flujo así generado está libre de pulsaciones y es independiente de la viscosidad del disolvente y de la columna. Sus desventajas son la limitada capacidad de disolvente y la dificultad de cambio entre disolventes.  

Las bombas neumáticas más sencillas constan de un recipiente plegable para la fase móvil, que se presuriza mediante gas comprimido. Se trata de bombas baratas y libres de impulsos, pero con capacidad limitada y presión de salida fija. Además el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la presión en la columna y no se pueden utilizar para obtener gradientes.

Para que los sistemas de bombeo funcionen correctamente es esencial que las fases móviles no contengan gases disueltos ni partículas en suspensión. Para ello se suelen utilizar desgasificadores, que pueden consistir en sistemas de bombeo por vacío, sistemas de destilación, dispositivos para agitar los disolventes o sistemas de purga que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante burbujas finas de un gas inerte de baja solubilidad. A veces los equipos de HPLC también contienen dispositivos para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. Desgasificadores y filtros no siempre forman parte del sistema de HPLC; ya que los disolventes pueden filtrarse y los gases disueltos pueden eliminarse, por ejemplo utilizando ultrasonidos, antes de ser introducidos en el sistema de HPLC.

Sistemas de inyección de la muestra:

Los sistemas de inyección hacen posible la introducción de la muestra sin despresurizar el sistema y sin sobrecargar la columna. Habitualmente la muestra se suele introducir mediante bucles de muestra, dispositivos integrados en el equipo e intercambiables que permiten variar el volumen de muestra inyectado. Por otro lado, la mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan inyectores automáticos, si bien suele ser también posible la introducción de la muestra de manera manual. Los  sistemas de inyección son un componente fundamental del HPLC, ya que un factor limitante en la precisión de una separación cromatográfica es la reproducibilidad con la que se pueda introducir la muestra en la columna.

Detectores:

Un detector es un instrumento con la capacidad de percibir la presencia de un compuesto y enviar la señal eléctrica correspondiente a un ordenador de registro. Las características ideales de un detector son múltiples, se pueden citar la alta sensibilidad, la respuesta lineal para los diferentes analitos, la reproducibilidad y el tiempo de respuesta corto. Además resulta interesante que el detector presente una respuesta semejante para todos los analitos, o alternativamente una respuesta selectiva y altamente predecible para una o más clases de analitos.

Según las características y concentraciones de los compuestos implicados en la separación cromatográfica se puede escoger el detector más adecuado para cada aplicación. De manera general se distinguen dos tipos básicos de detectores. El primero de ellos engloba los que están basados en la medida de una propiedad de la disolución, que se verá afectada por la presencia en la misma de las moléculas que se van a separar, destacando los detectores que miden el índice de refracción, la constante dieléctrica y la densidad. El segundo tipo está formado por aquellos que miden una propiedad de los compuestos que se desean separar, destacando los de absorbancia, los de fluorescencia y los de espectrometría de masas.

Una práctica común en HPLC es el uso de dos detectores, colocados en serie o en paralelo en función de las características de la muestra, fundamentalmente de la concentración de las moléculas de interés.

Columnas:

Las columnas son un elemento esencial para que transcurra la separación cromatográfica. La fase estacionaria está contenida en un tubo con terminaciones, aislada por ambos lados, que debe ser capaz de contener la presión generada en su interior tanto durante su fabricación como durante su uso. Las columnas deben  proporcionar un camino controlado y adecuado para la entrada y la salida de la muestra, sin fugas, con el mínimo volumen posible y sin volúmenes muertos. Además deben ser químicamente inertes respecto al sistema de separación (muestra, fase móvil y fase estacionaria).  

La mayor parte de las columnas están construidas en acero inoxidable para conseguir la mayor resistencia posible a la presión. El PEEK (un plástico de última generación) y el cristal, aunque son menos resistentes a la presión, pueden usarse cuando se requieren superficies inertes para aplicaciones especiales de tipo químico o biológico. La columna de cristal ofrece la ventaja de poder detectar visualmente la separación que tiene lugar en su interior.

Las dimensiones de una columna se deben escoger en función de la escala de separación cromatográfica que se va a realizar, analítica o preparativa. En las separaciones analíticas se utilizan columnas con pequeño diámetro interno, con la única finalidad de cuantificar e identificar los componentes presentes en una mezcla. Sin embargo, en la cromatografía preparativa se emplean columnas con diámetros internos mayores, para purificar y colectar compuestos puros a partir de una mezcla compleja, usando para ello un colector de fracciones situado a continuación del detector. Por otro lado, la longitud de la columna suele estar determinada por el grado de separación entre componentes que se desee obtener.

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