Laboratorio Cromatografía
Enviado por Maciel Jaramillo • 22 de Abril de 2021 • Apuntes • 437 Palabras (2 Páginas) • 83 Visitas
Prelaboratorio N2 Metodos cromatograficos
La cromatografía permita la separación de soluto basándose en la velocidad con la que se mueven cada uno de los solutos a través de un medio poroso a través de un disolvente en movimiento.
La capacidad de reparto entre las fase móvil y estacionaria es la causa de la separación de los solutos, esto depende del grado de afinidad entre el soluto y su fase estacionaria.
Cuando se utilizan columnas cromatográfica, observaremos que la fase móvil permitirá el arrastre del soluto y lo recepcionaremos, esto lo conoceremos como eluyente.
El eluato es la molécula que egresa de la columna.
Las cromatografías se separan en 5 grupos:
- De reparto (en papel)
- De adsorción
- De intercambio iónico
- De exclusión molecular (Los tubitos recepcionarán se denominarán fracciones)
- De afinidad
Cromatografía de reparto
Se realiza utilizando mínimas cantidades de sóluto (ej: aminoácidos, colorantes, pigmentos), se utiliza como criterio de pureza(es útil en identificación de aminoácidos)
Fundamento: velocidad a la que se mueven los solutos en fase estacionaria(aguaretenida en soporte solido e interte, celulosa) cuando es arrastrado por un disolvente(fase móvil)
MATERIALES:
- Cámara cromatográfica
- Papel filtro o soporte de nitrocelulosa
- Patrones y MP
- Solvente orgánico. Mezcla
Procedimiento:
Marcar el papel filtro con un lápiz cada 1 centímetro donde cargaremos la muestra. Estas se cargan con micropipetas 10 ul o 20 ul
Colocar mezcla de acetonitrilo, lo ideal no más de un cm3. Tapamos la cámara, app 5 minutos. Tomamos nuestro papel filtro y lo colocamos en la cámara. El papel debe quedar sobre la fase móvil, no mojándolo. Avanzará por capilaridad.
Los aminoácidos de tipo apolares avanzará a medida que avance la fase móvil, al contrario con los polares. Se permitirá que se saque el cromatograma un centímetro antes de terminar el papel. Lo sacaremos y marcaremos el frente (se aprecia una mancha).
El papel no permite ver nada, por lo tanto se utilizará tinción con ninhidrina, esta tiñe todos los aminoácidos de color azul-purpura, menos prolina.
[pic 1]
El Rf corresponde a la distancia recorrida por el soluto/distancia recorrida por la fase móvil.
[pic 2][pic 3][pic 4][pic 5][pic 6]
Cromatografia de exclusión molecular
Es un método muy utilizado para separar proteínas y péptidos. Permita la separación de proteínas aminoácidos y ADN, según su tamaño y peso molecular.
Requiere una fase móvil (generalmente solución tampón) y una fase estacionaria (sephadex, agarosa o poliacrilamida).
[pic 7][pic 8][pic 9]
Primeramente, nos permite separar, y luego cuantificar o identificar.
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