Laboratorio Cromatografía

Prelaboratorio N2 Metodos cromatograficos

La cromatografía permita la separación de soluto basándose en la velocidad con la que se mueven cada uno de los solutos a través de un medio poroso a través de un disolvente en movimiento.

La capacidad de reparto entre las fase móvil y estacionaria es la causa de la separación de los solutos, esto depende del grado de afinidad entre el soluto y su fase estacionaria.

Cuando se utilizan columnas cromatográfica, observaremos que la fase móvil permitirá el arrastre del soluto y lo recepcionaremos, esto lo conoceremos como eluyente.

El eluato es la molécula que egresa de la columna.

Las cromatografías se separan en 5 grupos:

• De reparto (en papel)
• De adsorción
• De intercambio iónico
• De exclusión molecular (Los tubitos recepcionarán se denominarán fracciones)
• De afinidad

Cromatografía de reparto

Se realiza utilizando mínimas cantidades de sóluto (ej: aminoácidos, colorantes, pigmentos), se utiliza como criterio de pureza(es útil en identificación de aminoácidos)

Fundamento: velocidad a la que se mueven los solutos en fase estacionaria(aguaretenida en soporte solido e interte, celulosa) cuando es arrastrado por un disolvente(fase móvil)

MATERIALES:

• Cámara cromatográfica
• Papel filtro o soporte de nitrocelulosa
• Patrones y MP
• Solvente orgánico. Mezcla

Procedimiento:

Marcar el papel filtro con un lápiz cada 1 centímetro donde cargaremos la muestra. Estas se cargan con micropipetas 10 ul o 20 ul

Colocar mezcla de acetonitrilo, lo ideal no más de un cm3.  Tapamos la cámara, app 5 minutos. Tomamos nuestro papel filtro y lo colocamos en la cámara. El papel debe quedar sobre la fase móvil, no mojándolo. Avanzará por capilaridad.

Los aminoácidos de tipo apolares avanzará a medida que avance la fase móvil, al contrario con los polares. Se permitirá que se saque el cromatograma un centímetro antes de terminar el papel. Lo sacaremos y marcaremos el frente (se aprecia una mancha).

El papel no permite ver nada, por lo tanto se utilizará tinción con ninhidrina, esta tiñe todos los aminoácidos de color azul-purpura, menos prolina.

[pic 1]

El Rf corresponde a la distancia recorrida por el soluto/distancia recorrida por la fase móvil.

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 Cromatografia de exclusión molecular

Es un método muy utilizado para separar proteínas y péptidos. Permita la separación de proteínas aminoácidos y ADN, según su tamaño y peso molecular.

Requiere una fase móvil (generalmente solución tampón) y una fase estacionaria (sephadex, agarosa o poliacrilamida).

[pic 7][pic 8][pic 9]

Primeramente, nos permite separar, y luego cuantificar o identificar.

[pic 10] 

Video: G50, indica el límite de exclusión del sephadex

El volumen de elusión permite determinar la constante de distribución (indica qué tan eficiente fue nuestra distribución)

[pic 11][pic 12]

Dalton = [gr/mol]

No cualquier sephadex nos sirve!

[pic 13]

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