Laboratorio de Espectrofotometría

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Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias de la Vida

Departamento de Ciencias Biológicas

Laboratorio y Seminario de Bioquímica General

Biol 261

                           Laboratorio de Espectrofotometría

                                                                                                                               Profesores

                                                                                                                        Ximena Ortega

                                                                                                                               Integrantes

                                                                                                                         Benjamin Forner

                                                                                                                                Niel Farias

                                                                                                                 Francisca Fuenzalida

                                                                                                                                     sección

                                                                                                                                           300

Introducción

                 A continuación se realizó el experimento de cuantificar la concentración de moléculas en una muestra a través de la técnica de Espectrofotometría. Espectrofotometría significa “medida del espectro de la luz” y se refiere a la medida del tipo y cantidad de luz que se obtiene de una disolución ⁵.    

     Para enriquecer la comprensión de este término, podemos darla a entender como el procedimiento analítico para medir la cantidad de luz absorbida por una sustancia con respecto a una longitud de onda determinada ⁶.

           Los componentes principales de un espectrofotómetro vendrían siendo: una fuente de luz que  emite un amplio espectro de ondas longitudinales; el monocromador que selecciona una longitud de onda determinada de la fuente de luz y la transmite. Luego la luz del monocromador pasa a través de la muestra, situada en una cubeta de paso óptico, y es absorbida por la muestra en proporción a la concentración de la especie absorbente, es decir,         que a mayor concentración de la muestra a estudiar, mayor será el espectro de absorbancia. Finalmente la luz transmitida se mide mediante un detector ⁷.

         Si bien se utiliza la medida de absorbancia para detectar e identificar moléculas y para medir sus concentración en disolución. La fracción de la luz que incide en el monocromador y es absorbida por una disolución a una longitud de onda determinada, está relacionada con el espesor de la capa absorbente (paso óptico) y con la concentración de la especie absorbente. estas dos relaciones se combinan en la ley de lambert- beer ⁷.

         La ley de Lambert-Beer estipula que la luz incidente es paralela y monocromática (de una sola longitud de onda) y que las moléculas de disolvente y de soluto están orientadas al azar.

Es importante observar que cada milímetro sucesivo de paso óptico de la solución absorbente  en una cubeta de 1,0 cm no absorbe una cantidad constante,  sino una fracción constante de la luz que incide en él. No obstante, con una capa absorbente proporcional a la concentración del soluto absorbente.

Como se clarificó anteriormente, a menor concentración de la muestra en análisis, menor será la absorción del espectro de luz en la muestra ⁷.

      Es importante mencionar que el coeficiente de absorción molar varía con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, la longitud de onda, y también con el ph si la especie absorbente de luz está en equilibrio con un estado de ionización que tiene diferentes propiedades de absorbancia⁷.

Objetivos

• Identificar la longitud de onda de máxima absorción por medio de la técnica de Espectrofotometría, del azul de metileno.
• Determinar el coeficiente de extinción molar del azul del azul de metileno
• Determinar de la muestra problema la concentración por medio de una curva de calibración.

Materiales y métodos

• Actividad práctica 1: En primer lugar se recibirá 0,5 mL de una solución stock de azul metileno la cual tiene una concentración de 1 mg/mL . esta solución deberá ser diluida para obtener una concentración de 0,005 mg/mL.

A partir de la solución de 0,005 mg/mL habrá que medir la absorbancia a ciertas longitudes de onda, que son 400,450,500,550,600,650,700,750 nm. En este paso se deberá incluir un blanco de agua cada vez que se cambie de longitud de onda.

Una vez ya medidos los valores de absorbancia se tendrá que determinar la longitud de onda del máximo de absorción. cuando ya se tenga claro cuál es el rango en que se encuentra el valor de máxima absorbancia. se debe comenzar a medir de 10 en 10 nm la absorbancia para así obtener un valor más exacto.

Una vez ya encontrado el valor más exacto de máxima absorbancia habrá que determinar el coeficiente de extinción molar a partir de la concentración de la solución de azul metileno.

• Actividad práctica 2: Para comenzar se deberá preparar 4 mL de una solución de azul de metileno con una concentración de 0,01 mg/mL a partir de una solución stock de 1 mg/mL. posterior a eso se deberan 4 diluciones seriadas de 2 mL final cada una de manera que la solución se vaya diluyendo a la mitad.

Para cada una de las soluciones que se prepararon anteriormente se deberá determinar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción.

Posterior a esto se deberán graficar los resultados obtenidos en la actividad anterior y discutir si en el gráfico se cumple la ley de Lambert.Beer.

• Determinación de la concentración de una muestra problema de azul metileno: Recibirá una muestra problema con concentración desconocida. En primer lugar se deberá medir la absorbancia de esta muestra.

Usando el gráfico de la actividad anterior deberá determinar la concentración de la muestra.

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