Metodo Cromatografico

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE ZACATECAS

“Francisco García Salinas”

Área Académica de Ciencias de la Salud

UNIDAD ACADEMICA DE CIENCIAS QUIMICAS

Programa educativo de Químico Farmacéutico Biólogo.

ANÁLISIS QUÍMICO III

CROMATOGRÁFIA.

Presenta:

FRANCISCO MANUEL DELGADO GONZALEZ.

Docente:

Q.F.B. MÓNICA IMELDA MARTINEZ ACUÑA.

AGOSTO DEL 2012

MÉTODO CROMATOGRÁFICO.

Introducción a la cromatografía.

En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de lo que hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna a diferentes velocidades. Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En el experimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno de ellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química. Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodos cromatográficos según el estado físico de la fase móvil. En una primera etapa la cromatografía de líquidos se realizaba en columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realizó Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria sólida por lo general era de 150 a 200 μm. Incluso así, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas décimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separación eran largos (varias horas). Los intentos para acelerar el procedimiento clásico mediante la aplicación de vacío, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del mínimo característico que se observa en las gráficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia. En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se dieron cuenta de que se podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminuyendo el tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los años sesenta cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de partícula del orden de los 3 o 10 μm. Esta tecnología requiere una instrumentación sofisticada, que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica. Para distinguir estos procedimientos más nuevos de los métodos básicos, que todavía se utilizan con fines preparativos, se emplea la denominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

Tipos de cromatografía.

La cromatografía es un método de separación y análisis basado en el uso de una fase estacionaria y una móvil. Los componentes de una muestra se hacen pasar por una fase estacionaria mediante el flujo de una fase móvil de manera que las sustancias se distribuyen entre las dos fases; aquellos solutos cuya relación de distribución sea favorable a la fase estacionaria quedan retenidos por ésta, mientras que los solutos que se encuentran preferentemente en la fase móvil serán los primeros en arrastrar. De esta forma los solutos serán separados en orden creciente a sus coeficientes de distribución con respecto a la fase estacionaria. El conjunto de técnicas que se valen de una fase móvil que se desplaza a lo largo del sistema y una fase estacionaria que permanece fija reciben el nombre de cromatografía.

Los métodos cromatográficos pueden ser clasificados:

1. Según el dispositivo utilizado para conseguir poner en contacto la fase estacionaria y fase móvil:

• Cromatografía en columna: consiste en columnas huecas de longitud y diámetro variable en cuyo interior hallamos la fase estacionaria. La fase móvil se hace pasar por ellas ya sea por gravedad o aplicación de presión.

• Cromatografía plana: la fase estacionaria se encuentra sujeta por una placa plana o en papel (cromatografía en capa fina y en papel, respectivamente) y la fase móvil se desplaza por ella mediante capilaridad o influenciada por la gravedad.

2. Según los estados de las fases implicadas, en especial de la fase móvil:

• Cromatografía de gases: En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado(0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor capacidad de separación.

• Cromatografía de líquidos: La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido).

La cromatografía de líquidos (siempre la fase móvil es un líquido) puede realizarse con diferentes arreglos experimentales:

• En columna

• En papel

• En capa fina

En la cromatografía en columna, la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido-líquido; en la cromatografía en capa fina, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme.

• Cromatografía de fluidos supercríticos (cualquier sustancia que se halle en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico).

3. Si nos centramos en la cromatografía líquida podemos clasificarla, también, según el mecanismo de interacción del soluto con la fase estacionaria:

• Cromatografía de reparto o partición: se vale de una fase estacionaria líquida que forma una película sobre un soporte sólido. La distribución del soluto vienen dada por el equilibrio entre la fase estacionaria y móvil. Se utiliza para especies poco polares pero no iónicas de masa molecular menor de 104 g/mol.

• Cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido: el soluto presente en una fase móvil líquida o gaseosa se adsorbe a las partículas sólidas de la fase estacionaria. La separación de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y móvil. Se utiliza para especies no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos de masa molecular menor de 104 g/mol.

• Cromatografía de intercambio iónico: consiste en hacer pasar una fase móvil líquida sobre una fase estacionaria que presenta grupos iónicos en su superficie de modo que los iones de signo opuesto quedarán retenidos por fuerzas electrostáticas. Se utiliza para especies iónicas de masa molecular menor de 104 g/mol.

• Cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía en gel: Se basa en la habilidad de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamaño y forma de las moléculas. Se utiliza para solutos con masa molecular mayor de 104 g/mol.

• Cromatografía de afinidad: emplea interacciones específicas entre una clase de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente a la fase estacionaria.

Clasificación de las separaciones cromatográficas

Tipo Fase móvil Fase

estacionaria Método de fijación de la fase

estacionaria

Reparto o

Partición Líquido Líquido Adsorbida en un sólido poroso

sostenido en una columna tubular

Absorción Líquido Sólido Sostenida en una columna tubular

Papel Líquido Líquido o

Sólido Sostenida en poros de un papel grueso

Capa fina Líquido Sólido finamente dividido sostenido

sobre una placa de vidrio: el líquido

puede absorberse sobre las partículas

Gel o de

exclusión por

tamaño Líquido Líquido Sostenido en los intersticios de un

polímero sólido

Cambio iónico Líquido Resina Resina

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