Microscopía Óptica

MICROSCOPIA OPTICA

23-2 Microscopio Óptico.

23-3 Poder de Resolución: es la capacidad del instrumento para brindar imágenes distintas desde puntos muy cercanos.

Límite de resolución: la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales.

23-4 Fijación del Material

Fijados, deshidratados, incluidos y seccionados.

Fijador: Se utiliza para que, al morir las células, las estructuras que poseían en vida se conserven con un mínimo de artificios.

Congelación-Desecación: consiste en la congelación rápida del tejido y su

Deshidratación en el vacío a baja temperatura. Se usa Nitrógeno líquido y Helio líquido.

Ventajas de este método son obvias no causa retracción del tejido. La fijación es homogénea y no hay extracción de sustancias solubles. La composición química y la estructura se mantienen.

La rapidez de la fijación permite sorprender a las células en momentos funcionales críticos.

23-5. Corte del material,

Micrótomos: instrumentos para el corte del tejido en láminas delgadas.

Para colorearlo se utiliza Parafina o Celoidina. Hay que deshidratarlo. Si se usa parafina se hace con Xileno, tolueno, Benceno. Si se usa Celoidina se utiliza etanol-éter.

Crióstatos: micrótomos situados en el interior de cámaras enfriadas con CO2 líquido, llamados micrótomos de congelación o crióstatos.

Vibráfonos: son micrótomos de congelación provistos de una navaja vibrátil.

23-6 Coloración del material

Colorantes tisulares: son de naturaleza orgánica y aromática Se reconocen dos tipos de colorantes. los básicos y los ácidos.

Grupo cromóforo:  El que imparte el color.

Metacromasia: colorantes básicos del grupo de las tiazinas que tienen la propiedad de teñir ciertos componentes celulares con un color diferente del que caracteriza al colorante como la tionina, el azur A y el azul de toluidina.

23-7. Microscopio de fase

Retrasos: cambios de fase (las amplitudes de onda no cambian, pero si su velocidad).

Intensidad: cambios de amplitud.

Para observación en vivo de la mitosis en células cultivadas.

23-8. Microscopio de Interferencia.

Se basa en el de fase pero con resultados cuantitativos. Muestra los cambios en el índice de refracción que no lo hace el de fase. Se usa para observar en vivo la mitosis en células.

23-9 Fondo Oscuro.

Posee un condensador que ilumina el material oblicuamente.

Se pueden descubrir estructuras más pequeñas que con el óptico.

23-10 Microscopio de Polarización

Isotrópico: la luz polarizada se desplaza a través del medio con la misma velocidad.

Las sustancias y estructuras isotrópicas se caracterizan por tener el mismo índice de refracción en todas las direcciones. En los anisotrópico la velocidad de propagación de la luz polarizada es distinta según su dirección.

Birrefringente porque presenta dos índices de refracción distintos. que corresponden a dos velocidades de transmisión de la luz.

La Birrefringencia es positiva si el índice de refracción es mayor que cuando sigue el plano perpendicular. mientras que es negativa en la situación contraria.

MICROSCOPIA ELECTRONICA

23-11. Electrónico de transmisión

Permite conocer la ultraestructura de las células y de la matriz extracelular ya que posee un poder de resolución mayor que el del microscopio óptico.

Tiene grandes diferencias con el microscopio óptico: algunas de las cuales corresponden al mecanismo de formación de la imagen.

En el microscopio electrónico dicho mecanismo se basa en la dispersión de los electrones, que al chocar con los núcleos de los átomos del material se dispersan de forma tal que caen por fuera de la apertura de la lente del objetivo. En esta dispersión -llamada elástica- la imagen observada en la pantalla fluorescente refleja la ausencia de esos electrones. A los que logran pasar la dispersión se llama inelástica.

La dispersión de los electrones depende del espesor y la densidad molecular del material y del número atómico de los átomos que Jo componen. A mayor número atómico, mayor dispersión.

el material debe ser procesado con átomos pesados para aumentar su contraste.

23·12 Corte del material.

Como materiales de inclusión se utilizan resinas de epoxi, que impregnan los tejidos y luego se polimerizan con catalizadores apropiados.

Para lograr cortes muy delgados se utilizan ultramicrótomos, que emplean cuchillas de vidrio o de diamante.

el material debe ser deshidratado para poder soportar el vacío al que se lo someterá.

Metodología de monocapas : las macromoléculas se extienden sobre una interfase aire-agua antes de ser colocadas sobre una película. Este procedimiento ha dado excelentes resultados para la observación de moléculas de ADN y de ARN.

23-13 Aumento de contraste entre los componentes del material.

El empleo de sustancias que poseen átomos pesados -como osmio. uranio y plomo- permite obtener un aceptable contraste entre los componentes de la célula y los tejidos.

Para estudiar algunos procesos biológicos -como la incorporación de macromoléculas o de partículas por endocitosis- se utilizan trazadores. Que poseen un alto grado de opacidad a los electrones. Los trazadores permiten detectar las vías por las que son transportadas ciertas sustancias. tanto entre las células como dentro de ellas.

Los trazadores suelen ser enzimas cuyos productos son opacos a los electrones.

Por ejemplo. las peroxidasas que se detectan mediante el uso de peróxido de hidrógeno y 3,3-diarninobencidina.

Uno de los trazadores más pequeños es la microperoxidasa, que tiene un peso molecular de sólo 1.9 k.Da.

Sombreado: Método para aumentar el contraste que en las fotomicrografías da lugar a imágenes con un aspecto tridimensional no conseguido con los otros métodos.

En la coloración negativa, el material es embebido en una gota de un líquido denso. por ejemplo, fosfotungstato. Este penetra en todos los espacios vacíos entre las macromoléculas. las cuales aparecen bien delimitadas y con un contraste negativo.

23-14. Congelación-fractura de membranas celulares y congelación-grabado de células

Congelación-fractura (criofractura) :  análisis de la ultraestructura interior de las membranas celulares.

Congelación-grabado: Estudio ultramicroscópico de las demás estructuras de la célula.

Ambas técnicas se basan en el congelamiento rápido del tejido y su fractura con un

Instrumento cortante.

23-1 S. Microscopio electrónico de barrido.

SEM (por scanning electron microscop) se pueden obtener imágenes topográficas tridimensionales de los materiales sujetos a estudio.

23-16 Reconstrucción de imágenes a partir de micrografías electrónicas.

Para moléculas o estructuras supramoleculares dispuestas en forma de cristales se obtiene información detallada a partir de electromicrografías poco claras.

23-17. Difracción de rayos X

Estructura molecular a nivel atómico.

ESTUDIO DE LAS CELULAS VIVAS

23-18. Cultivo celular.

Uno de los métodos más empleados para estudiar las células vivas.

Primarios: Directamente de los animales o de los vegetales. Se tratan con tripsina que disocia los agregados celulares y genera una suspensión de células libres que se cultivan en una cápsula de Petri.

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