Métodos directos de determinación de biomasа

DETERMINACIÓN DE BIOMASA

OBJETIVOS

Objetivo General:

Determinar la concentración de células por conteo en cámara Neubauer. Expresándolas en unidades de células/mL.

Objetivo Específico:

Reconocer la técnica de contaje en Cámara Neubauer.

Comparar estadísticamente los valores de concentración obtenidos; de manera general y manera aleatoria, mediante los métodos de variabilidad y desviación estándar.

FUNDAMENTO TEÓRICO

Biomasa es un término general quese refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproducción de células.

La determinación de biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso, ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico. Una variedad de análisis están disponibles para la determinación de Biomasa de muestras biológicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomycescerevisae).

Métodos directos de determinación de biomasa: Se basan en el número de células o en el peso celular, dentro de estos métodos podemos distinguir a los siguientes:

1. Métodos gravimétricos (Peso Seco)

La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en g.m.s/mL.

2. Métodosespectrofotométricos.

Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez.Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia.

3. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras

El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células/ml, generalmente).

CÁMARA DE NEUBAUER. Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será: concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4).

Conteo en cámara de Neubauer, Esta cámara se utiliza para conteo celular.

Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.

Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.

Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, este debe quedar centrada.

Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.

La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Figura 1. Conteo por Cámara Neubauer. Representación de la cuadricula 10 X.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales e Instrumentos

Levadura Saccharomycescerevisae

CamaraNeubauer

Jeringa

Laminilla cubreobjetos

Lámina Portaobjetos

Tubos de ensayo

Microscopio

Metodología

Con una jeringa se tomará una cantidad de la solución

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