OBSERVACIÓN MACROSCOPICA Y MICROSCOPICA

OBSERVACIÓN MACROSCOPICA Y MICROSCOPICA

Practica 6. [pic 1]

          Mesa 5                                                        Grupo: 571

PROPÓSITO

El alumno aprenderá a distinguir los tipos de bacterias sembradas en un agar mediante el análisis microscópico y macroscópico, Así como también se espera que distinga los diversos métodos que se utilizan en cada análisis.

INTRODUCCIÓN

Tinción de Gram: Es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias Gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias Gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

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Morfología: Disciplina encargada del estudio de la estructura de un organismo o sistema y sus respectivas características.1​ Esto incluye aspectos de la apariencia externa (forma, color, estructura) así como aspectos de la estructura interna del organismo como huesos y órganos. En contraste con la fisiología que estudia principalmente la función de estas estructuras.

Macroscópico: Que se ve a simple vista sin ayuda del microscopio.

Colonia: Agrupación de microorganismos de una misma especie. Tienen un olor agradable o desagradable; fetal o frutal, armonical, nauseabundo…

• Tamaño: Grande, mediano, pequeño, pequeñísima.
• Aspecto: opaco, brilloso, transparente, rugoso, algodonoso, aterciopelado.
• Color: amarillo, rojizo, blanco, cremas.
• Forma: redonda, alargada, irregular.
• Altura: Plana, elevada, cóncava, convexa.
• Cantidad de crecimiento de cultivo: Abundante, abundantísimo, escaso, y muy escaso.

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Tipos de cultivo: Cada figura aislada es un cultivo de bacterias.

• Cultivo puro: Está formado por un solo tipo de microorganismos.
• Cultivo mixto: Es la presencia de dos o mas especies de microorganismos en el cultivo.
• Cultivo contaminado: Es cuando aparece un germen extraño fuera de la línea de siembra.

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Microscópico: Todo aquello que no se puede ver a simple vista y que para poder verlo es necesario aumentar la forma de verlo mediante un microscopio. Según esta definición un cuerpo es microscópico cuando solo es posible verlo mediante un microscopio. Un ejemplo son los microbios. 

Cocos: Son bacterias que tienen forma esférica.

Bacilo: Tiene forma de varillas, y ocasiona grandes enfermedades como la tuberculosis, tétanos y tifoidea.

Espirilos: Son helicoidal parecido a un saca corchos.

Vibrio: Son bacilos curvado en forma de coma.

Cocobacilos: microorganismos que combinan:

• Forma de bacilo (bastón), y
• Forma de coco (esférica).

Dos ejemplos son las bacterias Haemophilus influenzae y Bordetella pertussis.

Estereoscopio: Es un instrumento óptico a través del cual se crea la ilusión de profundidad de una imagen, ya que por cada ojo se puede observar una misma imagen plana pero desde un ángulo diferente, que luego al interconectarse en el cerebro y unirse, se genera la ilusión de profundidad o de relieve de la misma. [pic 5]

Microscopio: Su función es la observación y estudio de objetos pequeños y preparaciones. Los microscopios se componen de una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y funciona por refracción. Fue formado por Anton Van Leeuhoek.

Las Partes principales son:

• Ocular: donde acercas los ojos para ver.
•  Platina: es esa especie de pequeño plato, donde se coloca el portaobjeto, donde está lo que quieres observar.
•  Foco: Este control sirve para enfocar el objetivo, para tener mejor nitidez y observar los detalles.[pic 6]
•  Condensador: Es el lente que está debajo de tu objetivo, sirve para concentrar la luz sobre el mismo.
• Lentes: Están justo encima del objetivo. Según el modelo de microscopio puede tener un revolver, con distintos valores de aumentos para seleccionar.

Incubadora: Es un equipo cerrado que permite controlar la temperatura, humedad y otras condiciones necesarias para el desarrollo de un cultivo microbiológico.

Bacterias: son microorganismos procariotas que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros (por lo general entre 0,5 y 5 μm de longitud) y diversas formas, incluyendo filamentos, esferas (cocos), barras (bacilos), sacacorchos (vibrios) y hélices (espirilos).

Portaobjetos: Pequeños trozos de vidrio. Se utiliza para preparar el frotis.

Mesofilos aerobios: Son todas aquellas bacterias aerobias, mesófilas capaces de crecer en agar nutritivo. Se investigan por el método de recuento en placa con siembra en profundidad, que se basa en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo sólido (Agar para recuento en placa o PCA), donde se ha sembrado un volumen conocido de la solución madre o sus diluciones (1 ml) , incubadas a 37° C durante 24 hs.

ESTERILIZACION Y PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

MATERIAL

• 1 guante de asbesto
• 4 cajas Petri
• Papel estraza
• 2 mecheros bunsen
• Matraz
• 1 probeta

REACTIVOS

• Agar nutritivo

PROCEDIMIENTO

1. Esterilizar la mesa de trabajo con la ayuda del cloro y la franela.
2. Encender dos mecheros a cada extremo de la mesa de trabajo para generar una zona estéril.
3. Lavar las cajas de Petri, secarlas y envolverlas  en papel estraza en forma de paquete de tortillas, asegura el papel estraza utilizando el masquen tape.
4. Colocar cinta testigo en los papeles. Colocar el material en la autoclave de manera que el calor circule por todo el equipo.
5. Esterilizar el material por 15 minutos. Secar el material de la autoclave. Colocar en la zona estéril de la mesa para preparar el medio de cultivo.

PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO (SE REALIZA SIMULTANEAMENTE)

1. Pesar la cantidad correspondiente para preparar 100ml de agar.
2. Disolver el reactivo con el agua destilada indicada.
3. Utilizar un matraz Elen Meyer.
4. Disolver 2.3gr del agar en 100ml de agua.
5. Mezclar y calentar a punto de hervir de 1 a 3 minutos.
6. Tapar el matraz con algodón y gasas.
7. Esterilizar en la autoclave.
8. Después retirar el medio de cultivo de la autoclave y verterlo uniformemente en las 4 cajas Petri.

SEMBRADO DE BACTERIAS

MATERIAL

• 4 tubos de ensaye
• 1 pipeta
• 1 propipetero
• 1 gradilla
• Agares anteriores

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 20gr de muestra en condiciones de asepsia.
2. Homogenizar en 180 ml de buffer.
3. Tomar 1ml de la muestra homogenizada y colocar en un tubo de ensaye con taparrosca identificado con un 101. Agregar 9ml de buffer de fosfato.
4. Tomar 1ml de 101, colocarlo en el tubo 102 y agregar 9ml de buffer de fosfato.

 Repetir los pasos anteriores.

1. Colocar 1ml en 20 ml en el centro de la caja Petri, previamente etiquetadas por el factor de dilución.
2. Adicionar de 12 a 15ml de agar método estándar esterilizado y enfriado a 45° C en cada caja Petri.
3. Homogenizar la muestra y el agar de la siguiente manera:

1. Realizar 6 movimientos de derecha a izquierda.
2. Luego 6 movimientos circulares en sentido de las manecillas del reloj.
3. Después 6 movimientos en sentido contrario de la misma manera.
4. Y por ultimo, 6 movimientos en sentido contrario de la misma manera.

1. Dejar solidificar el agar e incubar en posición invertida a 37°C por 48 horas

Después realizar el conteo de bacterias y realizar los cálculos correspondientes

OBSERVACIÓN MACROSCOPICA

MATERIAL

• 1 Lupa
• 1 linterna
• 1 hoja de papel milimétrico
• Agares de la práctica anterior

PROCEDIMIENTO

1. Esterilizar y colocar dos mecheros a cada extremo de la mesa.
2. Utilizar estereoscopio y realizar observaciones macroscópicas.
3. Reportar en forma de tabla.
4. Después realizar el conteo de bacterias y realizar los cálculos correspondientes.

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA

MATERIAL

• 2 Mecheros
• 1 Aza De Nicromio
• 3 Portaobjetos
• 1 Microscopio

REACTIVOS

• Cristal Violeta
• Yodo-Lugol
• Alcohol-Acetona
• Safranina

PROCEDIMIENTO

1. Recoger tres muestras de diferentes colonias de bacterias y colocarlos en los portaobjetos, extendiendo la muestra con el aza de nicromio.
2. Dejar secar a temperatura ambiente.
3. Fijar la muestra con calor de la llama de un mechero pasando el portaobjetos dos veces por encima de la llama.
4. Cubrir la preparación con 2-3 gotas de cristal violeta por 60 segundos y lavar suavemente con agua.
5. Cubrir la preparación con 2-3 gotas de Yodo-Lugol por 60 segundos y lavar suavemente con agua.
6. Cubrir la preparación con 2-3 gotas de alcohol-acetona durante 30 segundos y lavar suavemente con agua.
7. Cubrir la preparación con safranina por 60 segundos y lavar suavemente con agua. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
8. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
9. Realizar la observación microscópica de cada frotis.
10. Reportar en forma de tabla.

CONCLUSIÓN

La conclusión es que al realizar esta práctica de laboratorio incremento nuestros conocimientos sobre los análisis microscópico y macroscópico así también como la realización de la tinción de Gram y la identificación de los tipos de microorganismos que se encontraron presentes en los frotis preparados.

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