Obtención de aceite esencial y purificación de anís estrellado (illicium verum)

1. ESTUDIO FITOQUÍMICO

1.1 Material Vegetal

La raíz de Valeriana pilosa fue colectada en el departamento de Cundinamarca, municipio de Choachí – Vereda agua dulce.

1.1.1 Extracción y fraccionamiento

El material seco fue molido en una licuadora industrial obteniendo un polvo que fue almacenado protegido de la luz. El extracto etanólico fue preparado empleando 2.5 Kg del material vegetal molido utilizando el método de percolación. Se realizó la extracción con etanol al 96% hasta agotamiento por seguimiento en CCD. El extracto etanólico obtenido fue concentrado usando un rotavapor a 40 °C y desecado en una estufa a 30 °C. Al extracto etanólico se le realizó un estudio fitoquímico preliminar con el fin de identificar los principales grupos de metabolitos reportados en el género Valeriana.

Para la determinación de alcaloides se realizaron las pruebas de precipitación con los reactivos de Mayer y Dragendorff. Adicionalmente, se empleó CCD utilizando como agente revelador el reactivo de Dragendorff. En cuanto a los flavonoides se usó la prueba de Shinoda y para los compuestos fenólicos la prueba de cloruro férrico. La detección por CCD se llevó a cabo utilizando como agente revelador NP-PEG (DifenilboriloxietilaminaPolietilenglicol). La determinación de terpenos se realizó a través de la prueba de Lieberman-Burchard y mediante CCD usando como agente revelador el reactivo de Godin. (1)

1.1.2 Determinación e Identificación de iridoides 

Se realizó en el extracto etanólico y en las fracciones mayoritarias; empleando como fase móvil una mezcla de cloroformo-metanol (95:5) y como agente revelador una mezcla de ácido clorhídrico-ácido acético en proporciones 8:2; con posterior calentamiento de la placa a 110 °C durante 5 minutos o hasta la aparición de manchas azules. El revelador empleado produce manchas de coloración azul clara u oscura correspondientes a iridoides de tipo dieno, además si se producen manchas de color café clara u oscura indica la presencia de iridoides de tipo monoeno (Wagner y Bladt, 1984). Adicionalmente, se realizó la prueba de identificación (reacción de coloración) .El fraccionamiento se realizó utilizando el método de Kupchan modificado como se observa en la Figura 1.1 (Giraldo, 2010). Se emplearon 50 g de extracto etanólico de V. pilosa. Al final se obtuvieron las siguientes fracciones: Fracción acuosa (FA), fracción butanólica (FB), fracción de diclorometano (FD), fracción hexánica (FH) y fracción metanólica (FM) (1)

[pic 1]

Figura 1.1- Esquema de fraccionamiento líquido-líquido por el método Kupchan modificado.

1.1.3 Aislamiento y purificación de metabolitos secundarios

Con base en el rendimiento de las fracciones y la presencia de metabolitos secundarios de tipo iridoide, se seleccionó la fracción de diclorometano (FD) como fracción de interés para el aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios. Para llevar a cabo el aislamiento y purificación se utilizó cromatografía en columna por gravedad (CC) (silicagel 60-0.063-0.200 mm Merck® y Lipophilic Sephadex, LH20100- 506, 20-100 μm, Sigma-Aldrich® ), cromatografía en capa delgada (CCD) (cromatofolios AL TLC, silicagel 60 F254 Merck® ). Las técnicas se seleccionaron de acuerdo a la naturaleza de la muestra, la cantidad de muestra y el estado de pureza de la misma. Para realizar el seguimiento a las fracciones obtenidas se utilizó cromatografía en capa delgada (CCD) (cromatofolios AL TLC, silicagel 60 F254 Merck). En cuanto a la selección de la fase móvil se realizó teniendo en cuenta la naturaleza y polaridad de los metabolitos, empleando mezclas de disolventes con diferente polaridad. Los solventes metanol (MeOH), hexano (Hex) acetona (AcO), tolueno (Tol) y acetato de etilo (AcOEt) empleados fueron de la marca J.T Baker ; por otro lado diclorometano (CH2Cl2) y cloroformo (CH3Cl) fueron de la marca Merck(1)

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