PRACTICA 3 PROTEÍNAS I

PRACTICA 3

PROTEÍNAS I

INTRODUCCIÓN

Dada la compleja estructura proteica y por lo tanto su elevado peso molecular, las proteínas son consideradas como macromoléculas. Este carácter macromolecular, determina una serie de propiedades que posibilitan el aislamiento y análisis de las proteínas.

Lo anterior determina que las proteínas sean incapaces de atravesar membranas semipermeables, lo que posibilita que en una solución en donde existen proteínas y otros constituyentes de menor peso molecular (aminoácidos, monosacáridos, urea, creatinina, sales, iones, etc.), las primeras pueden ser separadas al no poder pasar a través de los poros de las membranas semipermeables; en tanto que los otros constituyentes, de menor peso molecular pasarán sin problema alguno.

En el experimento 1, se aplicará esta propiedad, para aislar las proteínas del suero sanguíneo. Igualmente se identificarán los 2 grandes tipos de proteínas del suero sanguíneo (albúmina y globulina) por su solubilidad en el agua y en soluciones salinas diluidas.

De otro lado, las proteínas tienen un rol muy destacado en el control del pH celular y extracelular. Esta acción amortiguadora se explica por la presencia de grupos ionizables en las cadenas laterales de los aminoácidos, los cuales son capaces de fijar protones y evitar que el pH baje; o ceder protones al medio para neutralizar los oxihidrilos y evitar de este modo que el pH aumente (Figura 1).

La concentración de hidrogeniones en el medio en que se encuentra disuelta una proteína, determina importantes variaciones en la carga eléctrica de la misma. En general, una proteína se carga positivamente cuando se encuentra disuelta en un medio de pH inferior al de su punto isoeléctrico (PI); en tanto que se carga negativamente cuando el pH del medio en que se encuentra es superior al valor de su Pl.

El punto isoeléctrico de las proteínas con un alto contenido en aminoácidos básicos (histidina, lisina y arginina), es alto, como el caso del citocromo c, que tiene un valor de PI de 10.7. Cuando una proteína tiene un alto contenido en aminoácidos dicarboxílicos (aspártico y glutámico), tendrán un PI bajo, como el caso de la pepsina que tiene un PI cercano a 1. En general, la mayor parte de las proteínas globulares tienen un PI que varía entre 5.0 y 9.0.

Cuando la proteína está en un medio de pH que coincide con el valor de su PI, no sólo es incapaz de migrar en un campo eléctrico sino que su solubilidad llega al mínimo, incluso algunas llegan a precipitar.

Un aspecto muy importante que debe tenerse en cuenta al hablar de las proteínas, es que la actividad biológica de estas macromoléculas depende de la integridad de su estructura en todos los niveles de estructuración. Cuando esta estructura se ve afectada, como cuando la proteína se despliega o se pliega en forma diferente a la proteína nativa, se dice que la proteína se ha desnaturalizado y en esta situación, la función biológica de la proteína, se pierde.

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Figura 1. Mecanismo de acción de los grupos ionizables de los aminoácidos para explicar la acción tampón de las proteínas.

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS

1. Separación de proteínas por diálisis.
2. Acción tampón de las proteínas del suero sanguíneo.
3. Desnaturalización de las proteínas y actividad biológica

EXPERIMENTO 1.1.

SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR DIÁLISIS

Objetivos

1. En base al carácter macromolecular de las proteínas utilizar un método para separarlas de otros componentes de menor peso molecular.
2. Estudiar el efecto de la fuerza jónica sobre la solubilidad de las proteínas del suero sanguíneo.
3. Constatar la acción del ácido tricloroacético (TCA) como agente precipitante de las proteínas.

Método

Diálisis del suero sanguíneo utilizando como membrana semipermeable una bolsa de celofán.

Procedimiento

1. Medir en el interior de una bolsa de celofán, 5 ml. de suero sanguíneo y cerrar la bolsa.
2. Colocar la bolsa de celofán en el interior de un beaker conteniendo agua destilada, la misma que debe ser renovada cada cierto tiempo (20 minutos).
3. Al notar algo de precipitado en el interior de la bolsa, vaciar su contenido a un tubo de centrífuga y centrifugar por 5 minutos a 2500 rpm.
4. Separar el sobrenadante en un tubo de ensayo y añadirle 5 ml. de ácido tricloroacético al 10%. Observar lo que sucede.
5. Trate de disolver el precipitado que quedó en el tubo de centrífuga utilizando agua destilada; de no ser posible, añada unas gotas de NaCI al 10% y observe si dio resultado.

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Resultados  

1. Escriba si observó precipitado en el interior de la bolsa y a qué puede corresponder.

1. ¿Qué observó al añadir el ácido tricloroacético al 10%?

1. Fue posible disolver el precipitado del tubo con agua destilada?. ¿Qué ocurrió al añadir el Na CI al 10%?

Interrogantes

1. ¿Por qué es necesario renovar el agua destilada del beaker cada cierto tiempo?

1. ¿Cuál es el fundamento de la precipitación de las proteínas por el ácido tricloacético?

1. Con qué experimento(s) podría Ud. demostrar que las proteínas no difundieron a través de la bolsa de celofán?

1. Complete la siguiente Tabla

EXPERIMENTO 1.2.

ACCIÓN TAMPÓN (BUFFER) DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO SANGUÍNEO

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