PRÁCTICA No. 10 CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

PRÁCTICA No. 10

CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

Objetivo

Aplicar algunas técnicas básicas para el cultivo de microorganismos anaerobios.

Introducción

Existen dos clases de anaerobios: los anaerobios aerotolerantes, que toleran el oxígeno y crecen en su presencia aunque no pueden usarlo, y los anaerobios estrictos que son inhibidos o incluso mueren en presencia de oxígeno. Se desconoce la razón por la que los anaerobios estrictos mueren en presencia de oxígeno, pero puede deberse a que son incapaces de eliminar algunos productos tóxicos que se originan en el metabolismo del oxígeno.

        Como el oxígeno está presente en el aire se requieren métodos especiales para excluirlo. Los anaerobios estrictos varían en su sensibilidad al oxígeno, de modo que existen diversos procedimientos para reducir el contenido en O2 de los cultivos; algunos muy simples y adecuados para los organismos menos sensibles, pero otros más complejos y necesarios para el crecimiento de los anaerobios estrictos.

        Para los organismos que no son demasiado sensibles a pequeñas cantidades de oxígeno, llenar completamente las botellas o tubos con medio de cultivo hasta arriba y cerrar con tapones herméticos, permite condiciones anóxicas adecuadas. También es posible añadir un compuesto químico que sea un agente reductor capaz de reaccionar con el oxígeno y reducirlo a H2O. Un buen ejemplo es el tioglicolato, que se añade a un medio denominado caldo de tioglicolato, y normalmente se usa para ver cuáles son los requerimientos de O2 de un organismo.

[pic 1]

Figura 2.

        Para eliminar por completo toda traza de O2 del cultivo de anaerobios, puede colocarse un gas que reaccione con el O2 en una jarra que a su vez contenga los tubos o placas. El dispositivo más sencillo es la jarra de anaerobios; el aire del recipiente se reemplaza luego por una mezcla de H2 y CO2, y las trazas de O2 que pudieran quedar en el contenedor o en el medio se consumen por acción de un catalizador químico, estableciéndose las condiciones anóxicas.

Materiales y equipo

Procedimientos

1. Tomar 1g de materia fecal o de suelo
2. Depositarlo en el tubo con 3mL de H2O
3. Homogeneizar.
4. Hervir durante 5 min.

 Cultivo en medio sólido

1. Con el asa esterilizada tomar un inóculo de la muestra previamente hervida.
2. Sembrar por estría cruzada en las cajas con medio de Brewer.
3. Rotular las cajas marcado una para anaerobiosis y la otra para aerobiosis.
4. Incubar una de las cajas en condiciones aeróbicas.
5. La segunda caja depositarla en una jarra de anaerobios y cerrar perfectamente.
6. Incubar ambos cultivos a 37oC durante 48 horas.

Cultivo en medio líquido

1. Con una pipeta Pasteur tomar  un inóculo de la muestra hervida.
2. Depositar 2 gotas en el fondo de un tubo conteniendo caldo tioglicolato.
3. No agitar los tubos
4. Hacer lo mismo con los cultivos proporcionados.
5. Colocarlos  en una gradilla e incubar a 37 oC durante 48 horas.

Observación y análisis de resultados

1. Comparar el crecimiento obtenido en las cajas incubadas en aerobiosis y en anaerobiosis.
2. Seleccionar una colonia de la caja incubada en anaerobiosis y realizar su morfología colonial y una tinción de Gram.
3. Observar el crecimiento en caldo tioglicolato y anotar en una tabla los resultados obtenidos.
4. Hacer una discusión y conclusión de sus resultados.

Cuestionario

1.    Investigar la composición química de los medios de cultivo utilizados en la práctica.

2.    Indicar que función tiene cada uno de los componentes de estos medios.

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