Practica 1. Expresión de GFP en E.coli-pGLO bajo diferentes concentraciones de inductor (arabinosa) y represor (glucosa)

Practica 1. Expresión de GFP en E.coli-pGLO bajo diferentes concentraciones de inductor (arabinosa) y represor (glucosa)

Introducción:

Un gen es un pedazo de DNA el cual provee las instrucciones para hacer (o codifica para) una proteína. Esta proteína le da a un organismo una característica particular. La transformación genética ocurre cuando una célula incorpora dentro de ella y expresa un nuevo pedazo de material genético ( DNA). Esta nueva información genética muchas veces provee al organismo de una nueva característica que se puede identificar luego de ocurrida la transformación. Transformación genética literalmente significa cambio causado por genes e involucra la inserción de uno o más genes en el organismo en orden de cambiar las características del organismo.

S utilizará un procedimiento que transformará la bacteria E. coli con un gene que codifica para una proteína fluorescente de color verde (GFP). Este gene ha sido extraído de una medusa que es fluorescente y bioluminiscente, Aequorea victoria. La proteína fluorescente verdosa causa que la medusa florezca y brille en la oscuridad. Seguido del proceso de transformación, la bacteria expresa el gene de medusa adquirido y produce la proteína fluorescente, la cual causa que la colonia brille de un verde brillante bajo la luz ultravioleta. (Referencia5)

En la naturaleza las bacterias pueden transferir plasmidos entre ellas permitiendo así compartir genes beneficiosos. Este mecanismo en la naturaleza le permite a las bacterias adaptarse a nuevos ambientes. Se utilizará el plásmido pGLO que contiene el gene para hacer la GFP. Se introducirá el pGLO a la bacteria E coli. realizando una transformación bacterial.

Los plasmidos pGLO únicos de Bio-Rad contienen además un gene de resistencia al antibiótico ampicilina (amp). El pGLO también incorpora un sistema especial de regulación genética. Este sistema puede ser usado para el control de la expresión de la proteína fluorescente en células transformadas. El gene para GFP puede ser activado o prendido en células transformadas al añadir el azúcar arabinosa al medio de cultivo donde crecen las células.(Referencia6)

Luego de realizar la transformación se crecen las células en medio LB y en presencia de ampicilina. La ampicilina evita que bacterias no transformadas crezcan en el plato de cultivo. Las colonias de células transformadas aparecen de color blanco en los platos que contienen medio LB y ampicilina. Para inducir la expresión del gene de GFP tenemos que crecer las bacterias en presencia de arabinosa. Las bacterias crecidas en LB con arabinosa y con ampicilina se verán fluorescentes de color verde en lugar de blancas.

Metodología:

Material proporcionado:

12 tubos de 16 X 100, cada uno con 2.5 ml de caldo nutritivo

1 tubo con 400 µl de ampicilina 10 mg/ml 1 tubo con 600 µl de arabinosa 5%

1 tubo con 600 µl de glucosa 5% 1 tubo con E.coli–pGLO™ (Kit166-0003EDU/Bio-rad), Incubado 6 horas 37°C/150 rpm

1. Etiquetar los tubos con el número correspondiente

2. Preparación de medio de cultivo con inductor y represor:

Volumen necesario que se debe tomar a partir de la solución

µl de cada solución stock/tubo

#11 Tubo 2 Tubo 5 Tubo 10 Tubo 11

Ampicilina 10mg/ml 25 25 25 25

Arabinosa (5%) 0 60 125 125

Glucosa (5%) 0 0 30 15

E-coli-pGLO 25 25 25 25

Resultado

Esperado - + - -

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