Practica 8 Método colorimétrico de sal de tetrazolium

Practica 8

Método colorimétrico de sal de tetrazolium

Objetivo.

• Que el alumno aprenda la importancia de métodos colorimétricos para la obtención de datos referentes a la proliferación celular.

Introducción.

La citotoxicidad celular se define como una alteración de las funciones celulares básicas que conlleva a que se produzca un daño que pueda ser detectado. (1)

Para evaluar el estado de citotoxicidad en un cultivo se pueden aplicar diversos métodos, pero el que se llevara a cabo en esta práctica es el método colorimétrico de la sal de tetrazolium; también llamado MTT.

El MTT es un compuesto perteneciente a la familia de sales de tetrazolio, soluble en agua y de color amarillo. (2) La prueba se basa en la formación de cristales de formazan que son metabolizadas por las mitocondrias activas de la célula, por lo que se puede evaluar la viabilidad celular en un cultivo, entre más cristales mayor es la cantidad de células vivas.

Equipo y materiales.

• Tubo cónico de 15 ml
• Laca fondo plano
• Cámara de Neubauer
• Pipeta de 10, 100 y 1000 μL
• Bata de laboratorio
• Lector de micro placas

• Azul de tripan
• Sal de tetrazolio
• Guantes de látex
• Cubre bocas
• Lentes de seguridad.

Procedimiento.

• Realizar el bioensayo en una micro placa de 96 pozos, donde se colocarán diferentes concentraciones de las células a evaluar (10, 2500, 5000 y 10 000 cel/mL). Se contarán en la cámara de Neubauer.
• La cantidad de células que se requieran se dispondrán en microtúbos o tubos cónicos de 15 m, los cuales se centrifugaran y de acuerdo con los cálculos los pellets se resuspenderan en el volumen correspondiente de DSF.
• Posteriormente, se plaquearan en el volumen final de 100 μL/pozo por cada uno, triplicando las condiciones utilizadas.
• Se incubará por 1 hora a 37°C en una atmosfera de 5% de CO2.
• Posteriormente se utilizará una solución de MTT a una concentración de 5mg/mL. Esta solución fue previamente esterilizada utilizando un papel filtro millipore 0.22 μm.
• Se adicionará 10 μL por cada 100 μL de medio a cada pozo de la placa donde se encuentran las células a evaluar e incubar durante 2-4 hrs.
• Se añadirá isopropanol acidico (100 μL 0.04; a cada pozo) y disolver los cristales color purpura.
• Se incubará durante 10 min a temperatura ambiente y leer la placa en un lector de ELISA a 570 nm y 655 nm (492-630 nm).
• En una hoja de cálculos se realizarán los cálculos que el instructor les facilitara y calificara en datos por dispersión.

Resultados.

Células totales: 22

Células vivas: 16

Células muertas: 6

CC = (16/4)(2)(10 000) = 80 000 cel/mL

*Solución No. 1

80,000 cel ------→ 1 mL

300,000 cel ----→ 3.75 mL

*Solución No. 2

80,000 cel -----→ 1 mL

150,000 cel ---→ 1.875 mL

*Solución No. 3

80,000 cel -----→ 1 mL

75,000 cel -----→ 0.9375 mL

Actividades.

1. Investigar otros métodos para evaluar citotoxicidad e indique su fundamento.

• Ensayo de captación de rojo neutro.

Esta prueba es una medida de la toxicidad de un compuesto a corto o largo termino, determinar por la liberación de un colorante (rojo neutro) debido a la perdida de la viabilidad celular.

El rojo neutro es captado por las células (específicamente por los lisosomas y endosomas) y en la medida que la célula pierda viabilidad por la acción del compuesto que se evalúa se libera al medio el colorante pues solo las células viables son capaces de retener el colorante en su interior. Seguidamente se determina la cantidad de rojo neutro que permanece después de la exposición dentro de la célula y calculada la concentración que produce la inhibición del 50% del crecimiento celular. Esto está basado en el hecho de considerar que un compuesto de división y multiplicación celular. Ello conlleva a una reducción de la velocidad de crecimiento celular reflejándose en el número de células presentes en el cultivo. El grado de inhibición del crecimiento relacionado con la concentración del compuesto que se evalúa con un índice de toxicidad.

...