Practica I: Actividad Ureásica en muestras de origen biológico

Practica No. I: Actividad Ureásica en muestras de origen biológico

INTRODUCCIÓN

La ureasa es una enzima amidohidrolosa de peso molecular: 480.kD, punto isoeléctrico: 5.0 y pH óptimo entre 6 y 7, cataliza la hidrólisis de la urea produciendo gas carbónico, hidróxido de amonio, según la reacción

En presencia de una solución buffer de fosfatos con pH = 7.0 y a una temperatura de incubación de 25°C, la ureasa presenta una constante de Michaelis de 10,5 mmol/L. Los principales inhibidores de su actividad enzimática son los iones metálicos pesados tales corno la plata (Ag+1) el mercurio (Hg+2) e igualmente el ácido hidroxámico y la tiourea La ureasa, se encuentra en varios tejidos vegetales como en el haba de soya, lo cual implica que pueda ser usada en análisis de alimentos para determinar urea, ya sea por el método de Kjeldhal o por titulación del amonio liberado. De esta forma, al titular el hidróxido de amonio producido por la hidrólisis, se puede calcular la cantidad de urea hidrolizada, utilizando el método estequiométrico, puesto que se producen 2 moles de NH4OH por cada mol de urea desdoblada. Por lo tanto, esta reacción puede utilizarse con éxito en la determinación de urea en sangre, orina, suelos y otros materiales orgánicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

1.1. Materiales y equipos requeridos

Material / Equipo Características

Tubos de ensayo Esta hecho de un Vidrio Especial que resiste las temperaturas muy altas, sin embargo los cambios de temperatura muy radicales pueden provocar el rompimiento de tubo.

Erlenmeyer 125ml Frasco con Base redonda, la cual posee una estructura conica en la zona del medio y en la zona superior se aprecia una boca con cuello estrecho. Cuando se habla de Matraz Erlenmeyer, se esta hablando de un matraz graduado que contiene marcas que indican un determinado volumen.

Pipetas 5 y 10ml permite medir la alícuota de líquido con bastante precisión. Suelen ser de vidrio. Está formada por un tubo transparente que termina en una de sus puntas de forma cónica, y tiene una graduación (una serie de marcas grabadas) con la que se indican distintos volúmenes.

Matraz aforado 100ml se emplea para medir con exactitud un volumen determinado de líquido. La marca de graduación rodea todo el cuello de vidrio, por lo cual es fácil determinar con precisión cuándo el líquido llega hasta la marca. La forma correcta de medir volúmenes es llevar el líquido hasta que la parte inferior del menisco sea tangente a la marca.

Baño termostato Es una fuente que provee calor, con el fin de mantener regulada la temperatura.

Beaker 500ml Se encuentran graduados. pero no calibrados, esto provoca que la graduación sea inexacta

Son de vidrio y de plástico. (posee un vidrio mucho mas resisitente denominado pyrex)

Posee componentes de Teflón y otros materiales resistentes a la corrosión

Su capacidad varia desde el mililitro hasta el litro.

Bureta 25ml son tubos cortos, graduados, de diámetro interno uniforme, prendiendo del volumen, de décimas de mililitro o menos. Su uso principal se da en volumetrías, debido a la necesidad de medir con precisión volúmenes de líquido variables

Soporte universal Accesorios del laboratorio

Pinzas para bureta Accesorios del laboratorio

1.2 Reactivos a utilizar

Reactivo Fórmula [ ]

Ureasa al 0,1% en Buffer Fosfato EC3.5.1.5 pH= 7

Urea (NH2)2CO 0,25M

HgCl2 HgCl2 1%

HCl HCl 0,1N

Indicador tashiro

1.3 Procedimiento

1.3.1. En campo: Obtener muestras de origen biológico: Alimento Vegetal, (presentación harina), una muestra de forraje, una muestra de suelo previamente seco al aire, concentrado y leche cruda.

1.3.2 En Laboratorio

EXTRACCIÓN Y SOLUBILIZACIÓN DE UREASA EN HARINAS, SUELOS O FORRAJE (MÉTODO “SALTING OUT”)

Pese 1g de muestra de harina, forraje o suelo, colóquelo en un tubo de centrifuga, agregue 10ml de NaCl al 1%, agite, centrifugue a 3500rpm, del resultado de la

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