Proceso de tinción de Gram

“TICION DIFERENCIAL (GRAM)

Propósito: El alumno aprenderá a facilitar la observación de montajes de materia viva mediante la aplicación de un colorante, para investigar morfología y estructura de microrganismos sin provocar alteraciones celulares o destruir las bacterias

Antecedentes: Tipo de tinción empleado en microorganismos para la visualización de baterías, sobretodo en muestras clínicas; la técnica es capaz de diferenciar 2 grandes grupos de eubacterias gram positivas y gram negativas.

Las Positivas: compuestas por una capa gruesa de peptidoglucano, son bacterias compuestas que se tiñen de azul oscuro o violeta, incluyen especies móviles y inmóviles.

Negativas: poseen una delgada capa de peptidoglucano, estas bacterias se tiñen de color rosas, muchas de estas especies causan enfermedades

MATERIAL SUSTANCIAS

portaobjetos Jabón liquido

Cubreobjetos Piseta con Agua estéril

Mechero de bunsen Alcohol etílico 95%

Pipeta Pasteur/ gotero Muestras bacterianas de origen natural: Yogurt, sarro dental o agua sucia

Microscopio Azul de metileno

Asa bacteriológica Aceite de inmersión

palillo Cristal violeta

Soporte de tinciones Lugol/ yodo de Gram

safranina

Actividad preliminar

Lee el procedimiento y realiza los dibujos correspondientes

Investiga que bacterias se encuentran en el yogurt, en agua sucia y en el sarro dental

Procedimiento

1. Lavar y desengrasar el portaobjetos y cubreobjetos: usar jabón líquido agua, enjuaga con alcohol etílico.

2. prepara las muestras siguiendo estos pasos:

3. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequeña cantidad de yogur con ayuda de un palillo higiénico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental extraído de la boca de alguien. Preparación del frotis o extendido:

• Producto o muestras solidas: Tomar una gota de agua estéril con el asa previamente esterilizada y se coloca en el centro del portaobjetos

• Con el asa estéril toma una pequeña muestra y mézclala perfectamente en con el agua

• Dejar secar al aire

• Fijación: Pasar rápidamente por la flama del mechero en el interior de la flama amarilla de 2-3 veces

a) Para muestras liquidas:

• Marcar una pequeña zona en el centro del portaobjetos en donde se deposite la muestra

• Colocar de 1 a 2 gotas de la muestra de yogurt co ayuda del el asa estéril(dejar enfriar el asa para evitar que los microrganismos sean destruidos)

• Distribuir la muestra en la zona marcada

• Dejar secar al aire y repetir paso 4-5, dos veces nuevamente dejar secar

• Fijar con dos gotas de alcohol y secar al aire o bien pasar rápidamente el portaobjetos por la flama del mechero de 2 a 3 veces

4. Tinción:

a) Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 2 min.

b) Se retirará el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para no desprender la muestra.

c) cubrir ahora con Lugol durante 2 min

d) se realizará otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta.

e) Se retirará el colorante con etanol al 95%, goteándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las células Gram- pierden el colorante violeta y quedarán incoloras. Las Gram + seguirían violeta

f) Añade una gota de agua a la preparación

g) cubre las preparaciones durante 2 min. con safranina (colorante de contraste).Finalmente, lava el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las bacterias Gram –, que quedarán rojas. Las Gram + seguirán violetas.

Tinción negativa

1. colocar una pequeña gota

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