Tincion De Gram

Introducción

De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado conetanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) elcolorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Objetivos

 Reconocer la importancia de la Tinción de Gram en la taxonomía de las bacterias.

 Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia del objetivo de inmersión)

 Conocer y manejar las unidades de medida de las células y establecer comparaciones entre tamaños de procariotas y de eucariotas

 Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Desarrollo

MATERIAL NECESARIO:

 Cultivos de bacterias

Cristal violeta

 Lugol

 Alcohol acetona

 Safranina

Aceite de inmersión

 Papel de lentes

 Microscopio

Portaobjetos

 Asas de cultivo

 Mechero

 Medios de cultivo, yoghourt, bacterias de la cavidad bucal, exudados de heridas (en las infecciones purulentas de la piel es fácil encontrar Staphilococcus pyogens y Streptococcus thermophilus).

EXPLICACIONES.

Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos.

Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de pared bacteriana:

Pared Gram +

capa densa y uniforme de 200 a 800 A)

ácidos teicoicos

polisacáridos

proteínas (pocas veces)

glicopéptido (50% del peso seco)

Pared Gram -

capa interna delgada de 20 a 30 A cubierta por capas externas de densidad menor)

lipopolisacáridos

lipoproteínas

proteínas

glicopéptido (10% del peso seco)

El mecanismo de la tinción Gram es la reseñado en el siguiente esquema:

Productos que se utilizan Reacción y coloración de las bacterias

GRAM + GRAM -

1) Cristal violeta Células color violeta Células color violeta

2) Lugol solución iodada Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta. Se forma el complejo CV-I. Las células continúan teñidas de color violeta.

3) Alcohol Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las células que continúan teñidas de color violeta. Eliminación por extracción de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la célula.

4) Safranina Células no decoloradas; quedan teñidas de color violeta. Células decoloradas; se tiñen de color rosado.

TINCIÓN DE GRAM

PROCEDIMIENTO:

1. Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada o solución salina a la que, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el calor, pasando suavemente sobre la llama del mechero hasta que se seque. (tres veces).

EXTENSIÓN

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