Tincion De Gram

Tinción de Gram

I. Introducción

El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista, sin embargo, las colonias que se forman en medios solidos si son visibles, de esta manera se puede hacer una observación a simple vista o macroscópica, en las colonias se puede estudiar una serie de características que nos ayudan a una ligera identificación, como a nivel morfológico (forma de las colonias), elevación, margen o borde y color de las colonias; es decir que por medio de una observación macroscópica no se puede identificar al tipo de bacterias, es por esto que se debe realizar una observación microscópica.

Ramos y Pérez (2004), las células microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18-24 horas dan lugar a la aparición de masas visibles de células sobre medios solidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que está formada por un único tipo de microorganismo. Las colonias tienen una morfología característica que se estudia a simple vista con la ayuda de una lupa. Las características más importantes de las colonias y cuyo estudio tiene interés en la caracterización son los siguientes:

• Forma: puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada.

• Tamaño: se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm.

• Elevación: vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa, pulvinada (más elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresión central).

• Forma del borde: puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso y rizado.

• Superficie: puede ser lisa, rugosa, mate, brillante, transparente u opaca.

• Color: presencia de colores característicos y difusión de pigmentos en el medio.

• Capacidad de emulsión en agua: puede formar una suspensión uniforme, formar una suspensión grumosa o no se emulsiona.

En este laboratorio solo se tomó en cuenta la forma, borde, elevación y color.

La observación microscópica es una de las características de la microbiología y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (por ejemplo protozoarios), en el caso de las bacterias es necesario la coloración de los preparados para aumentar el contraste con el fondo. Existen diversos métodos de coloración para una observación microscópica, como ser: tinción de Ziehl Neelsen, coloración de esporas, coloración de flagelos, tinción de Gram, y muchos otros, el que nosotros realizamos fue el último.

Según Garcia (2010) las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan en la tinción de Gram. Sobre la base de su tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tienen que ver con la carga eléctrica, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).

Las Bacterias Gram positivas y Gram negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo.

García (2010), el material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de las células Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico, generalmente, 80% a 90% de la pared de la célula Gram positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram negativa, por otro lado contiene una capa mucho más delgada únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacaridos y lipoproteínas. Solo de un 10% a 20% de la pared de la célula Gram negativa es peptidoglicano.

Las células Gram positivas, a causa de que sus paredes celulares son más espesas en peptidoglicano y menos lípidos, no son permeables al disolvente, ya que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo así el espacio entre las moléculas y provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Mientras que para las Gram negativas se utiliza una coloración de contraste, habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fuscina básica. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

Madigan, Martinko, Parker (…..), las diferencias estructurales entre las paredes celulares de las Bacterias Gram positivas y Gram negativas son las responsables del diferente comportamiento de las células a la tinción de Gram. En dicha tinción, se forma dentro de las células un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram negativas puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram positivas. El alcohol deshidrata las Bacterias Gram positivas, que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Bacterias Gram negativas, el alcohol penetra rápidamente en la capa externa que es rica en lípidos y la fina capa de peptidoglicano no impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fácilmente.

En la tinción de Gram es importante respetar los pasos y los tiempos:

• Cristal violeta (1 minuto)

• Lavar

• Lugol (1 minuto)

• Lavar (Gram positivo)

• Decolorante

• Lavar

• Safranina (30 segundos)

• Lavar

• Secar y observar en el microscopio

II. Objetivos

• Observar macroscópicamente cinco colonias mixtas y dos colonias puras (controles) para clasificarlas de acuerdo a su forma, elevación, borde y color.

• Distinguir las bacterias gram positivas y gram negativas de un cultivo mixto utilizando dos controles través de la observación microscópica, por el método de tinción de gram para conocer sus características estructurales.

III. Materiales y reactivos

- 3 cajas Petri (2 Colonias puras y una mixta) - Alcohol

- 7 portaobjetos - Asa de inoculación

- Mechero Bunsen - Solución fisiológica

- Cristal violeta - Lugol

- Decolorante (alcohol acetona) - Colorante de contraste (safranina)

- Agua - Microscopio

- Aceite de inmersión - Gotero

IV. Procedimientos

Se realizó la práctica en 2 partes, primero se realizó una observación macroscópica y luego otra microscópica.

Inicialmente se limpió y desinfecto el área de trabajo con el uso de alcohol al 70%. Posteriormente se nos proporcionaron 3 cajas Petri, dos de ellas contenían colonias puras (bacterias de control) y la otra contenía colonias mixtas. Luego se clasificaron 5 colonias mixtas de acuerdo a su forma, elevación, borde, color y aspecto, de la misma forma se realizó la operación con las dos colonias puras.

Para hacer usó del asa de inoculación primero se lo flameo en el mechero hasta que se obtuvo un color rojo vivo, luego se mantuvo el asa dentro del área de esterilidad del mechero el cual es aproximadamente de 20 cm, y se lo dejo enfriar por algunos segundos. Paralelamente se lavó el portaobjetos y se colocó una gota de solución fisiológica estéril. Una vez que el asa enfrió se tomaron las bacterias encontradas al borde de cada colonia, las cuales fueron colocadas en el portaobjetos al costado de la solución fisiológica para posteriormente juntarlos y esparcir las bacterias con el fin de separarlas para una mejor observación. Se dejó secar la preparación hasta que el agua se evaporo por completo, entonces se fijó la muestra pasándola 3 veces por el mechero con la precaución de no quemarlas. Este procedimiento se repitió con las diferentes colonias previamente clasificadas.

Ya fijadas las muestras se prosiguió con la tinción de Gram la cual consistió en cubrir la muestra con cristal violeta durante 1 minuto, luego se lavó con agua de grifo. Se cubrió el extendido con lugol igualmente durante 1 minuto y se volvió a lavar con agua. Se puso un decolorante (alcohol-acetona) hasta que la muestra ya no desprendió el color violeta, nuevamente se lavó con agua. Se cubrió con safranina durante 30 segundos, de nuevo se lavó con agua y se dejó secar a temperatura ambiente. Una vez seca la muestra esta se observó por medio del microscopio con el objetivo de inmersión, identificando si la bacteria corresponde a una Gram (+) o Gram (-), también se sacaron fotos para la observación morfológica de dichas bacterias.

V. Resultados y discusión

Observación Macroscópica

Tabla Nº1

Cultivo Mixto 1 Cultivo Mixto 2 Cultivo mixto 3 Cultivo mixto 4 Cultivo Mixto 5 Control - Control +

Forma filamentoso circular puntiforme Circular rizoide circular circular

Margen Ondulado ondulado ondulado entero entero entero entero

Elevación elevado convexa plana elevado elevado elevado convexo

Color Blanco/crema Blanco/crema Blanco/crema Blanco/crema Blanco/crema Blanco/crema Blanco/crema

Tabla Nº2

Figura 1: Cultivo mixto-Colonia I Figura 2: Cultivo mixto-Coloni II

Figura 3: Cultivo mixto-Colonia III Figura 4: Cultivo

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