Propiedades del ADN

Propiedades del ADN

En el aislamiento de ADN una gran dificultades mantener una molécula tan larga y rígida físicamente intacta. Se ha demostrado que las fuerzas de corte que se alcanzan cuando una solución de ADN se agita vigorosamente, son suficientes para romper la molécula larga y rígida. Las moléculas se rompen al principio cerca de la mitad, después en cuartos y así hasta que se alcanza un tamaño tan corto que es relativamente insensible al rompimiento por corte.

Es difícil extrapolar el peso molecular del ADN encontrado en solución al peso molecular real que existe in vivo, debido a la gran facilidad de degradación por el corte durante la extracción o por la acción inadvertida de enzimas hidrolíticas.

Tal vez, las mejores estimaciones se derivan del trabajo radio-autogràfico, en el cual, el ADN se marca con tritio. Por ejemplo, en E. coli, Cirns pudo detectar moléculas de ADN mayores a 1,1 mm de longitud. Esto corresponde a un peso molecular de 2.8x109. De forma similar, el ADN del bacteriófago T2 tiene una longitud promedio de 49 micras, lo que corresponde a un peso molecular de 108. Un bacteroiófago un poco más pequeño, llamado lambda, tiene un ADN de 23 micras de longitud. Pero aún en las muestras preparadas de ADN más cuidadosamente extraído, hay siempre de 0.1 a 0.2% de proteína unida al material. Es así que existe la posibilidad de que una molécula de ADN esté realmente hecha de segmentos de ADN mantenidos unidos por material proteínico o peptídico (ver resumen en referencia 13). De cualquier forma, la síntesis exitosa in vitro por reacciones conocidas de la forma circular de la doble cadena de replicación de x174ADN, capaz de infectar células huésped, hace posible decir que esas moléculas de ADN están compuestas sólo de nucleótidos.

Un método para aislar el ADN casi libre de proteínas y ARN fue publicado, por ejemplo, por Marmur. Las paredes de células bacterianas son digeridas con la enzima lisozima, ó rotas con un detergente. El perclorato de sodio es usado para disociar proteínas y ácidos nucléicos, y la solución se desproteiniza por agitación con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico. El ARN se remueve con una ribonucleasa o por centrifugación en un gradiente de densidad de cloruro de cesio. En este gradiente, el ARN, que tiene una densidad mucho mayor que la del ADN, se aglomera en el fondo del tubo (de la centrífuga). El ADN se puede precipitar selectivamente con alcohol isopropìlico. El ataque por desoxirribonucleasas se puede minimizar si las operaciones se conducen en presencia de agentes quelantes o en presencia de un detergente como el dodecil sulfato de sodio. Este procedimiento produce ADN biológicamente activo, por ejemplo, ADN de transformación (o transcripción). El ADN obtenido, de cualquier forma, es en cierta medida degradado por las fuerzas de corte desarrolladas durante la agitación.

Un procedimiento alterno para aislar ADN altamente polimerizado de tejidos animales es el método de extracción fenólica de Kirby, en el que las proteínas se desnaturalizan en una interfase fenol-agua, y lo ácidos nucleicos se extraen en la fase acuosa. El ARN puede removerse y el ADN precipitarse como se menciona arriba.

Para el estudio en microscopio electrónico, las soluciones de ADN se rocían sobre la red (o malla) y se secan rápidamente. El ADN original da claramente moléculas más largas, con rigidez como de vara, mientras que las moléculas desnaturalizadas por calor o por otro medio (al azar en espiral) forman aros o rizos.

Casi todo el aDN original en solución, de una amplia variedad de fuentes, tiene la estructura de doble hélice como muestra el cambio hipercrómico (ver abajo) que ocurre cuando se calienta la solución de ADN.

Por otro lado, el ADN desnaturalizado es una cadena flexible, ligeramente enrollada y polielectrolítica, muy dependiente en sus propiedades hidrodinámicas del ambiente iónico. De hecho el ARN desnaturalizado en solución es un poco similar al ARN de alto peso molecular, que muestra alguna, más no completa, estructura secundaria.

Cercanamente similares son también los polirribonucleótidos sintéticos de una cadena hechos por la enzima polinucleótido fosforilasa. Un ejemplo de ADN de una sola cadena enrollada al azar ocurre naturalmente en el pequeño bacteriófago x 174.

En general, la estructura secundaria del ADN original depende de su contenido de pares guanina y citosina (g+C). A mayor contenido G+C, fuerzas de unión más fuertes mantendrán las dos cadena juntas. Esto es posible porque la guanina y la citosina pueden formar 3 puentes de hidrógeno cuando se parean en la estructura del ADN, mientras que la adenina y la timina sólo pueden formar 2.

El cambio hipercrómico es el aumento en la absorbancia cuando el ADN de doble cadena es desnaturalizado a la forma unicatenaria. En un caso análogo (fig 2.11) los 2 ribonucléotidos, el ácido poliadenílico y el poliuridílico, cuando se mezclan, tienen a 260 micrómetros una absorbancia menor a la calculada para los dos polímeros medidos por separado.

Esto es así porque estos polirribonucléotidos pueden formar pares de bases A-U. Los polidesoxirribonucléotidos, puede esperarse, actúen de manera similar. Otro medio de observación del cambio hipercrómico es destrozando la estructura bicatenaria de hélice a través de la acción hidrolítica de una nucleasa (fig 2.12)

Existe además el hipercromismo residual, que se presenta incluso en los polímeros de una sola cadena medidos por separado y que sólo se hace aparente cuando el polímero se rompe en mononucleótidos. Incluso los di o trinucleótidos presentan hipercromismo residual. Esto es probablemente debido a la interacción entre bases vecinas ligadas entre sí como los oligo o los polinucleótidos (ver “stacking apilado” en la pág 9).

La estructura original de ADN es estable a un pH de 2.7-12, y la molécula se desnaturaliza por arriba o por

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