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Protocolo de ensayos de Biología celular y Ultraestructura


Enviado por   •  23 de Agosto de 2015  •  Ensayos  •  2.268 Palabras (10 Páginas)  •  252 Visitas

Página 1 de 10

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CONTENIDO

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Electroforesis de células individuales (linfocitos) “Ensayo Cometa” [pic 11]

REACTIVOS

Preparación de Agarosa regular al 0.65%

Agar (gr)

Cantidad de agua destilada (mL)

0.325

50

0.162

25

0.13

20

0.0975

15

0.065

10

0.0325

5


Preparación de laminillas con Agarosa regular al 0.65%

Depositar 140 µL de agarosa regular en un porta objetos limpio (esmerilado) y estender con el ddo indice sobre todo el cubre objetos.

Dejar secar las laminillas en la estufa a 80°C.

Preparación de Agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) al 1%

Agar (gr)

Cantidad de agua destilada (mL)

0.50

50

0.25

25

0.20

20

0.15

15

0.1

10

0.05

5

Solución de lisis 1

(2.5M NaCl, 100mM (0.1M) EDTA, 10% DMSO, 1% Triton) · (100)

Cantidad de agua destilada (mL)

NaCl (gr)

EDTA (gr)

Tris-HCl (gr)

1000

146.44

37.02

1.20

500

73.22

18.51

0.604

250

36.61

9.257

0.302

150

21.96

5.55

0.181

100

14.64

3.70

0.120

50

7.32

1.85

0.060

25

3.36

0.92

0.030

Ajustar pH 10.

Preparación del cöplin

Agregar un volumen de 28 mL  (solución de lisis 1 + 2.8 mL de DMSO + 280 µL de Triton). Mantener a 4°C/ 4 h.

Solución de electroforesis

(NaOH 300mM, EDTA 200mM) 

Cantidad de agua destilada (mL)

NaOH (gr)

EDTA (gr)

1000

12

58.44

500

6

29.22

250

3

14.61

150

1.8

8.766

100

1.2

5.844

50

0.60

2.922

25

0.30

1.461

Ajustar pH 13. Mantener a 4°C/ 10 min., en un lugar oscuro.

Realizar electroforesis a 25V y 300mA/ 20 min.

Solución neutralizante

(0.4M Tris-HCl)

Cantidad de agua destilada (mL)

Tris-HCl (gr)

1000

48.456

500

24.228

250

12.114

150

7.286

100

4.857

50

2.428

25

1.214

Ajustar pH 7.5. Mantner en refrigeración constante a 4°C.

PROCEDIMIENTO

  1. Preparar los portaobjetos con agarosa regular al 0.65%, y secar a 85°C.
  2. Preparar el volumen indicado de agarosa de bajo punto de fusión al 1% a 37°C.
  3. Pipetear una alicuota de 80µL (20µL de la muestra (rango de concentración celular de la muestra 5 - 10 million mL-1.) + 80µL de LMPA) y depositarla en las laminillas pretratadas al 0.65%.
  4. Cubrir la muestra depositada con un cubreobjetos.
  5. Dejar solidificar a 4°C por 4 min.
  6. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos de la laminilla.
  7. Los portaobjetos son colocados dentro del cöplin con la preparación de lisis, a 4°C/ 24h.
  8. Posteriormente se raliza una corrida electroforética a 25V y 300mA/20 min, con un tiempo previo de reposo de 20 min.
  9. Una vez terminada la electroforesis, las laminillas son enjuagadas con agua destilada y solución neutralizante de manerera cuidadosa para asegurar la integridad de la agarosa.
  10. Finalmente son deshidratadas con metanol puro y se dejan secar al ambiente.
  11. Una vez secas se procede a la tinción con colorante Gel Green™ agregando un volumen de 35 µL (concentración 0.62 µL/ mL de agua destilada) por laminilla.
  12. Cubrir con un cubreobjetos y dejar reposar 10 min. en un lugar oscuro.
  13. Observar en microscopio de fluoresencia.

Electroforesis de células individuales (espermatozoides) “Ensayo Cometa”

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