Protocolo de ensayos de Biología celular y Ultraestructura

[pic 1][pic 2]

[pic 3]

[pic 4]

[pic 5]

[pic 6]

CONTENIDO

[pic 7]

[pic 8][pic 9][pic 10]

Electroforesis de células individuales (linfocitos) “Ensayo Cometa” [pic 11]

REACTIVOS

Preparación de Agarosa regular al 0.65%

Preparación de laminillas con Agarosa regular al 0.65%

Depositar 140 µL de agarosa regular en un porta objetos limpio (esmerilado) y estender con el ddo indice sobre todo el cubre objetos.

Dejar secar las laminillas en la estufa a 80°C.

Preparación de Agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) al 1%

Solución de lisis 1

(2.5M NaCl, 100mM (0.1M) EDTA, 10% DMSO, 1% Triton) · (100)

Ajustar pH 10.

Preparación del cöplin

Agregar un volumen de 28 mL  (solución de lisis 1 + 2.8 mL de DMSO + 280 µL de Triton). Mantener a 4°C/ 4 h.

Solución de electroforesis

(NaOH 300mM, EDTA 200mM) 

Ajustar pH 13. Mantener a 4°C/ 10 min., en un lugar oscuro.

Realizar electroforesis a 25V y 300mA/ 20 min.

Solución neutralizante

(0.4M Tris-HCl)

Ajustar pH 7.5. Mantner en refrigeración constante a 4°C.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar los portaobjetos con agarosa regular al 0.65%, y secar a 85°C.
2. Preparar el volumen indicado de agarosa de bajo punto de fusión al 1% a 37°C.
3. Pipetear una alicuota de 80µL (20µL de la muestra (rango de concentración celular de la muestra 5 - 10 million mL-1.) + 80µL de LMPA) y depositarla en las laminillas pretratadas al 0.65%.
4. Cubrir la muestra depositada con un cubreobjetos.
5. Dejar solidificar a 4°C por 4 min.
6. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos de la laminilla.
7. Los portaobjetos son colocados dentro del cöplin con la preparación de lisis, a 4°C/ 24h.
8. Posteriormente se raliza una corrida electroforética a 25V y 300mA/20 min, con un tiempo previo de reposo de 20 min.
9. Una vez terminada la electroforesis, las laminillas son enjuagadas con agua destilada y solución neutralizante de manerera cuidadosa para asegurar la integridad de la agarosa.
10. Finalmente son deshidratadas con metanol puro y se dejan secar al ambiente.
11. Una vez secas se procede a la tinción con colorante Gel Green™ agregando un volumen de 35 µL (concentración 0.62 µL/ mL de agua destilada) por laminilla.
12. Cubrir con un cubreobjetos y dejar reposar 10 min. en un lugar oscuro.
13. Observar en microscopio de fluoresencia.

Electroforesis de células individuales (espermatozoides) “Ensayo Cometa”

Solución de lisis 1

(2.5M NaCl, 100mM (0.1M) Na2 EDTA, 10mM (0.010)Tris, 200µg/mL Proteinasa K, 300mM (0.3M) DTT) · (100)

Ajustar pH 10.

Preparación del cöplin

Agregar un volumen de 28 mL  (solución de lisis 1 + 5.6 mg/mL de proteinasa K + 1.295 g de DTT). Mantener a 37.5°C.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la muestra

[Realizar diluciones en medio mHTF para obtener concentraciones de 5 - 10 million mL-1.]

1. Preparar los portaobjetos con agarosa regular al 0.65%, y secar a 85°C.
2. Preparar el volumen indicado de agarosa de bajo punto de fusión al 1% a 37°C.
3. Pipetear una alicuota de 50µL (20µL de la muestra + 50µL de LMPA) y depositarla en las laminillas pretratadas al 0.65%.
4. Cubrir la muestra depositada con un cubreobjetos.
5. Dejar solidificar a 4°C por 4 min.
6. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos de la laminilla.
7. Los portaobjetos son colocados dentro del cöplin con la preparación de lisis, a 37.5°C/ 2h.
8. Posteriormente se raliza una corrida electroforética a 25V y 300mA/20 min, con un tiempo previo de reposo de 20 min.
9. Una vez terminada la electroforesis, las laminillas son enjuagadas con agua destilada y solución neutralizante de manerera cuidadosa para asegurar la integridad de la agarosa.
10. Finalmente son deshidratadas con metanol puro y se dejan secar al ambiente.
11. Una vez secas se procede a la tinción con colorante Gel Green™ agregando un volumen de 35 µL (concentración 0.62 µL/ mL de agua destilada) por laminilla.
12. Cubrir con un cubreobjetos y dejar reposar 10 min. en un lugar oscuro.
13. Observar en microscopio de fluoresencia.

Extracción de ADN

(Técnica de Salting Out)

MUESTRA BIOLÓGICA

5mL de Sangre periférica con anticoagulante EDTA.

MATERIAL

1 Tubo falcon de 50 mL

1 Tubo falcon de 15 mL

1 Tubo Eppendorf de 1.5 mL

Piprtas plasticas

Pipeta automatica de 10-100 µL

Puntillas amarillas para pipeta de 10-100 µL

REACTIVOS

• Solución de Lísis de Eritrocitos (NH4Cl 155 mM, NaHCO3 10 mM y 500 mM EDTA pH 7.4):

        Disolver 8.29 g de NH4Cl y 0.84 g de NaHCO3 en 700 mL de agua ultrapura.

        Agregar 0.2 mL de EDTA 500 mM. Ajustar pH 7.4 y aforar a 1 L.

• Solución de Lísis para Leucocitos (Tris-HCl 10 mM, NaCl 400 mM, EDTA 2mM):

Mezclar 0.12 g de Tris-HCl, 2.33 g de NaCl y 0.07 g de EDTA. Ajustar pH 8.2 y aforar a 100 mL de agua ultrapura. Esterilizar en autoclave.

...