Pruebas Bioquimicas Micologicas

PRUEBAS BIOQUÍMICAS

LECHE TORNASOLADA

La leche con tornasol, es un medio diferencial que se emplea para determinar varias funciones metabólicas de un organismo, como la fermentación de la lactosa y a la vez identificarlo.

FUNDAMENTO.

El tornasol incorporado a la leche es un indicador de pH y de óxido-reducción. La leche por sí sola contiene lactosa y caseína lactalbúmina y lactoglobulina. Por lo tanto un organismo puede mostrar una o varias propiedades metabólicas en este medio, ayudando a su identificación, las propiedades que en este medio se observan son las siguientes:

FERMENTACIÓN DE LA LACTOSA

El tornasol como indicador de pH es rojo en un medio ácido (pH 4.5) y azul en condiciones básicas (pH 8.3). La leche tornasolada en sí, presenta color azul purpúreo y un pH de 6.8. Al inocular este medio con un microorganismo capaz de fermentar la lactosa, el medio se torna rojo rosado.

Lactosa Glucosa + Galactosa

ác. pirúvico

REDUCCIÓN DEL TORNASOL

Es un indicador de óxido-reducción y algunos organismos son capaces de reducirlo a una leucobase que en el medio se aprecia como una mancha blanca.

FORMACIÓN DE COÁGULO

La formación de un coágulo en la leche tornasolada es causada por la precipitación de la caseína, la cual se encuentra en forma de sal (caseinato de Ca) por la formación de ácidos o por la conversión de la caseína en paracaseína.

Al ser fermentada la lactosa, los ácidos que se forman, se combinan con el caseinato de calcio para dar caseinógeno produciendo un coágulo firme en las paredes del tubo y que al someterse a condiciones alcalinas se disuelve.

Lactosa Glucosa + Galactosa

ác. pirúvico

ác. láctico + caseinato de Ca caseinógeno ↓(ppdo insoluble)

INGREDIENTES

Leche descremada deshidratada 100g.

Polvo de tornasol 0.75g

Agua destilada 1000 mL

Para el indicador del pH (Tornasol)

Tornasol granulado 250g.

alcohol etílico 40% 1000 mL

INTERPRETACIÓN

Rojo rosado

reacción ácida

fermentación de lactosa

Azul purpúreo

No hay fermentación de lactosa

No hubo inóculo

Azul

Reacción alcalina

No hay fermentación de lactosa

el organismo ataca las sustancias nitrogenadas que se encuentran en el medio.

Blanco

reducción del tornasol a una leucobase

Formación del coágulo o cuajo

precipitación de la caseína

LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA

Tiene como objetivo determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan la gelatina. Estas enzimas son detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente en el medio.

El catabolismo de las proteínas por las gelatinasas es un proceso en dos etapas y el resultado final es la mezcla de aminoácidos individuales.

Proteína + H2O □(→┴█(Gelatinasas @proteinasas) ) Polipéptidos

Polipéptidos + H20 □(→┴█(Gelatinasas@polipeptidasas) ) aminoácidos individuales

Posterior a la hidrólisis, los aminoácidos separados son mezclados con una disolución de Ninhidrina y experimentan una reacción rápida produciendo un color púrpura

En esta prueba se utilizan diferentes medios, a continuación se presentan algunos:

MEDIO DE GELATINA DE KOHN (MÁS RECOMENDADO)

Ingredientes:

Gelatina nutritiva 15 g

agua corriente o destilada fría 100 mL

Carbón inactivado finamente pulverizado 3-5 g

formol 40 %

carbonato de calcio CO3Ca 1g

cloruro de sodio NaCl 0.9 g

En esta prueba la gelatinasa al licuar a la gelatina libera partículas de carbón , esta gelatina con carbón actúa como sustrato para determinar la actividad de la gelatinasa y no como medio nutritivo. Estas partículas liberadas determinan el índice de licuefacción de la gelatina.

La licuefacción se produce a los 37° C y posteriormente se licúa una pequeña cantidad de gelatina para que queden liberadas las partículas de carbón dando una prueba positiva.

INTERPRETACIÓN

1. Es POSITIVO si:

Las partículas libres de carbón se depositan en el fondo del tubo.

2. Es NEGATIVO si:

La mezcla de gelatina con carbón permanece intacta.

No se observan partículas libres de carbón en el medio.

MEDIO DE gelatina con tioglicolato pH: 7

INGREDIENTES

Casitona 15.5 g

Extracto de levadura 5 g

Dextrosa 2 g

NaCl 2.5 g

L- cistina 0.25 g

Sulfito de sodio 0.1 g

ácido tioglicólico 0.3 ml

agar 0.75 g

gelatina 50 g

agua destilada 1000 Ml

INTERPRETACIÓN

Es POSITIVO si:

el medio está licuado.

Es Negativo si:

El medio se mantiene sólido.

PRUEBA DE UREASA

Sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa.

FUNDAMENTO

El sustrato urea es una diamida del ácido carbónico. Todas las amidas (RCO-NH2) son rápidamente hidrolizadas.

La hidrólisis de la urea es catalizada por una enzima específica llamada ureasa, para dar dos moléculas de amoniaco, por lo que al encontrarse la urea en solución, se hidroliza dando carbonato de amonio como producto final. La ureasa actúa como sobre los enlaces C-N del compuesto, con excepción de los que contienen enlaces peptídicos. El pH óptimo para la actividad de la ureasa es 7.0

REACCIÓN

Los medios más empleados para llevar a cabo esta reacción son los siguientes:

CALDO DE UREA DE RUSTIGIAN Y STUART pH:6.8

Es un medio demasiado amortiguado y existen muy pocos elementos nutritivos por lo que si un microorganismo no puede utilizar el amoniaco, debe recurrir al extracto de levadura del medio para obtener el nitrógeno y el carbono. Si los nutrientes suministrados por el extracto de levadura se han consumido antes de que el organismo muestre un crecimiento apreciable no podrá determinarse con exactitud su capacidad para hidrolizar la urea.

Por el contrario, si el organismo es capaz de hidrolizar la urea pero no de utilizar el amoniaco como fuente de nitrógeno, no se produce el crecimiento dando un falso negativo.

INTERPRETACION

Reacción POSITIVA: Color rojo o rosado en todo el medio.

Reacción NEGATIVA: No hay cambio de color.

AGAR UREA DE CHRISTENSEN pH: 6.8

Elimina la necesidad de un microorganismo de utilizar los productos derivados de la urea como su única fuente de nitrógeno.

INTERPRETACIÓN:

Positivo: rojo rosado intenso en el picode flauta

Negativo: amarillo

HIDRÓLISIS DE LA CASEÍNA

La caseína es la proteína más abundante en la leche, ésta es una suspensión coloidal, es por esto que la leche tiene su apariencia turbia. Los microorganismos que producen caseinasa, hidrolizan a esta proteína, produciendo péptidod más pequeños y por tanto suspensiones más claras. A éste fenómeno se le conoce como peptonización.

Después de que la lactosa es fermentada se producen ácidos orgánicos que reaccionan con el caseinato de calcio para dar un coágulo de caseinógeno. Al hidrolizarse la caseína, se produce una conversión final del precipitado caseinógeno en un líquido claro.

Caseína → paracaseína □(→┴(Ca++) ) paracaseinato de calcio ↓

INTERPRETACIÓN

Es POSITIVA si: hay una formación de coágulo y se aclara el medio.

Es NEGATIVA si: No hay aclaración del medio.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Tiene como objetivo determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar al almidón por medios enzimáticos.

El almidón es un polisacárido que está compuesto de amilosa lineal (10-20%) y amilopectina ramificada (80-90%). Diversas enzimas amilolíticas hidrolizan almidón y sus productos.

La amilasa es la

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