Pruebas De Paternidad

Técnicas que se utilizan actualmente en las pruebas de paternidad

Historia.

Avances en las técnicas de biología molecular:

• 1953: James Watson y Francis Crick elucidaron la estructura de la molécula de ADN como una doble hélice.

• 1984: Alec Jeffreys descubrió el uso de RFLP en la identificación personal, en un caso de violación. Tuvo suerte, ya que en esta técnica se requieren grandes cantidades de muestra de ADN (es un inconveniente de la técnica), por lo que tuvo que haberse recogido mucha cantidad de semen (muestra) o pasó poco tiempo entre la ocurrencia del hecho y la recolección de ésta.

Otro inconveniente corresponde a la interpretación: Cada columna (1, 2, 3) corresponde a una muestra de sangre, de una persona, que fue sometida al contacto con enzimas de restricción y se produjo gran cantidad de cortes en la molécula de ADN, los cuales luego de la electroforesis en gel daban un patrón de este tipo:

Se relaciona con la migración de la molécula de ADN (ésta es negativa) migra hacia el polo positivo (+) y la migración se da de acuerdo con el tamaño del fragmento: el fragmento más pequeño migra más rápido ( ) y el fragmento más grande migraba menos (*) y por eso podían diferenciar a las personas. Entonces la interpretación (principalmente al inculpar a una persona) era complicada, pues cuando habían líneas muy cercanas entre sí entre las distintas columnas (muestras) costaba decidir si correspondían o no al mismo fragmento (o). La migración se ve afectada cuando: el gel se chorrea de un modo inadecuada o si las condiciones de éste no son iguales en toda su extensión; por ejemplo si en una zona hay mayor densidad de gel, la banda migrará más lentamente aunque sea del mismo tamaño que otra que esté en el otro extremo del gel (porque migra más fácilmente esta última en el gel).

Por otra parte, los VNTR son: un tipo de RFLP, fragmentos que andan en un tamaño entre 9 y 40 pb, son muy grandes si se habla de varios de éstos juntos conformando un segmento de ADN.

En 1986 (creo), aparece el PCR con la ventaja (sobre el RFLP porque generalmente en las ciencias forenses las muestras son escasa y muy pequeñas: gotas de sangre de sospechoso, pelo con folículo piloso, etc.) de que se puede trabajar con segmentos de ADN muy pequeños: 300- 800pb y obtener millones de copias de ese fragmento de ADN. Por lo tanto, esta técnica abrió una posibilidad grande en el trabajo de las ciencias forenses y arrastró su aplicabilidad a las pruebas de paternidad. Se amplifica una región específica del genoma y después de 28-30 ciclos, se obtienen millones de copias. ¿Cuál segmento de ADN se utiliza en ciencias forenses o en identificación humana (prueba de paternidad)? Aquellos segmentos de la molécula de ADN donde todos nos diferenciamos, ya que de no ser así no se lograría individualizar (y esto es lo que interesa). No se analiza toda la molécula de ADN, sólo ciertas regiones, ¿cómo se definen? Según investigaciones se han buscado regiones de este tipo, pero al trabajar deben cumplir las siguientes características:

1. Ser regiones bien estudiadas.

2. Ser regiones que han recibido como una validación internacional.

3. Primers deben estar respaldados por una empresa o industria que certifique que amplifican realmente la región de interés.

Así, la diferencia de trabajar en investigación y hacerlo en el campo forense está en que en el primer caso yo puedo hacer mis primers y hacer la investigación pero en el segundo caso la calidad de la prueba es esencial, se debe demostrar que el resultado que da la prueba es el que debe ser y que los reactivos permiten amplificar lo que se busca. Hay gente que ha querido montar la prueba con sus propios primers, pero con un buen abogado dicha prueba puede venirse abajo porque no se puede certificar la calidad de los primers debido a que, generalmente, éstos se hacen para investigación y si no sirve no importa, se trata de hacer uno nuevo pero en ciencias forenses se vigila y se cuestiona la calidad del trabajo y los equipos por un abogado asesorado por un perito o alguien que conoce sobre el tema.

¿Cuáles regiones del genoma son las que se utilizan para hacer la prueba?

Genoma completo -> ADN repetitivo -> No codificante (extragénico) – Altamente repetitivo y agrupado.

Es importante recalcar que a la gente le atemoriza que se conozca sobre su ADN porque puede ser utilizado en su contra, por ejemplo si alguien desea una póliza de seguro y se descubre (por algún medio poco ético) que dicha persona tiene un gen que posteriormente le va a desarrollar una enfermedad, se le afecta el trámite a la persona; es información muy sensible, el ADN es información privada y personal, nadie tiene derecho a analizarlo si no hay consentimiento y menos divulgar la información.

Para pruebas de paternidad se trabaja con ADN basura (no se conoce su funcionalidad); por lo que es importante explicarle a las personas, para su tranquilidad, que no se está trabajando con áreas que den información sensible y que no se va a divulgar. Del ADN no genómico altamente repetitivo se trabaja con los STR (Repeticiones pequeñas en tándem): una unidad repetitiva que no pasa de 7pb (de 2 a 7pb) y se repite n veces:

…AGTGATCGATGCATG GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA CTGATCGATC….

Unidad repetitiva (9 veces)

¿Por qué son importantes los STR en identificación humana? Por su tamaño: si se tiene una unidad repetida; en este caso 9 veces de 4pb, el tamaño total del fragmento es 32pb (4x9). Esto es importante porque cuando el ADN se expone a degradación, el ADN se fragmenta y, si se analizaran fragmentos grandes es probable que la prueba no dé nada porque se fragmentó. La posibilidad de que un segmento de gran tamaño se mantenga intacto, es muy pequeña. Por eso los STR son útiles además, en ciencias forenses.

En el genoma humano hay cientos de STR dispersos, todos tenemos el mismo STR, en el mismo lugar, con la misma unidad repetitiva; la particularidad está en el número de veces (n) en que está la unidad repetitiva y de ahí es de donde la literatura ha generado el número de alelos:

Alelo 5: Un STR que tiene 5 veces la unidad repetitiva

Alelo 6: Un STR que tiene 6 veces la unidad repetitiva

Alelo 7: Un STR que tiene 7 veces la unidad repetitiva

Todos tenemos este STR ( ) en el mismo lugar, la diferencia está en el número de veces en que ése se presenta.

En biología molecular se hace un PCR con primers externos (porque la secuencia de ADN sigue aguas arriba y aguas abajo del STR en cualquiera de los alelos y los 3 se van a amplificar, luego los pongo a migrar en un gel de acuerdo con su tamaño: los más grandes migran menos que los pequeños.

Volviendo a la genética: cada persona hereda un alelo de STR de la madre y el otro del padre.

Homocigosis: Mamá y papá me dieron el mismo número de unidades repetitivas.

Hererocigosis: Mamá y papá me dieron distinto número de unidades repetitivas.

Las 2 bandas migran iguales y quedan una sobre la otra. La banda más pequeña migra más rápido

Para esta prueba se utiliza:

 Control positivo: una muestra de la cual se saben los alelos que la componen y se usa como guía para comprobar que la prueba migró y dio bien.

 Escalera alélica: Que se obtiene de un reactivo que trae todos los posibles alelos existentes. Esto sirve para darle un número a los alelos y a las personas.

Viendo ahora la interpretación tenemos las diferentes líneas de la madre el padre y el hijo y lo que se hace es buscar cuales líneas se comparten y cuales son heredadas y de quien. Esta prueba es de mucho cuidado por la preparación del gel.

Siempre se revisan primero los alelos que son de la madre y ahí un alelo que el niño posee que se llama el alelo paterno obligatorio que el padre debe poseer también, sino se le debe excluir.

Esta también el llamado analizador genético que utiliza la electroforesis capilar que permite correr de 12 a 15 STR’s para una sola muestra. En este caso los alelos de tamaño similar que podrían migrar muy parecido van a estar marcados con diferentes fluorocromos y se pueden entonces diferenciar. Esto se interpreta de acuerdo al número de picos que la maquina nos dé cuando se analizan los datos. Un pico es homocigoto, dos picos es heterocigoto, 3 picos… en ese caso o cuando se tengan 4 bandas en un proceso de identificación se debe pensar ya en una contaminación con ADN extraño. Es muy común que se den estos casos en lo que son violaciones múltiples o asesinatos pero la muestra no se considera contaminada, si se le considera como tal cuando es posterior al hecho que se introduce mas ADN por algún error al tomar la muestra o al procesarla. El problema es distinguir cuando la muestra es mixta o es contaminada. Hay ejemplos de niños con Síndrome de Down en donde hay marcadores genéticos que caen en el cromosoma 21 entonces se pueden tener más bandas de la cuenta.

El equipo automáticamente compara los picos obtenidos con la escalera alélica y les da un número. Por ejemplo si le da un 11 al pico quiere decir que tiene 11 veces la unidad repetitiva de ese alelo. De esta manera se ve cuales padres le heredan al niño sus STR’s ya que el número de repeticiones

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