Pruebas de oxidaciÛn-fermentaciÛn

PNT-ID-01c. PRUEBA DE OXIDACI”NFERMENTACI”N

1. PROP”SITO Y ALCANCE

La prueba de oxidaciÛn-fermentaciÛn (Hugh y

Leifson), determina el tipo de metabolismo, oxidativo

o fermentativo, que utilizan las bacterias al actuar

sobre un hidrato de carbono. Se utiliza para la

diferenciaciÛn de gÈneros, principalmente de bacilos

gramnegativos.

2. FUNDAMENTO

En la vÌa oxidativa, el aceptor final de electrones

debe ser el oxÌgeno y por consiguiente el proceso es

aerobio y produce poca acidez; mientras que en la

vÌa fermentativa, el aceptor final de electrones es un

compuesto org·nico y el proceso es anaerobio,

originando mucha acidez.

La acidez se detecta por la presencia de un indicador

de pH (azul de bromotimol), que hace virar el medio

de verde a amarillo. Los microorganismos oxidativos

producen ·cido en la zona de contacto con el aire,

pero no lo hacen en profundidad. Los

microorganismos fermentativos producen mucho

·cido en todo el tubo.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Manual de bioseguridad

4. MUESTRAS

Colonias bacterianas crecidas en medio de cultivo

sÛlido

5. REACTIVOS Y MATERIALES

Se utilizan tubos con medio de Hugh-Leifson, un

medio semisÛlido, que contiene peptona a baja

concentraciÛn (0,2%), glucosa (1%) y azul de

bromotimol como indicador de pH.

Vaselina o aceite de parafina estÈril.

Asas desechables.

6. PROCESAMIENTO

6.1. PROCEDIMIENTO

Para cada bacteria en estudio se utilizan dos tubos

de oxidaciÛn/fermentaciÛn (O/F) con medio de HughLeifson

Se siembran ambos en picadura y se cubre uno de

ellos con vaselina o aceite de parafina estÈril.

Incubar a 35±2ºC en atmÛsfera ambiente.

Lectura: a las 24-48 h, aunque a veces es necesaria

una incubaciÛn de hasta 14 dÌas.

6.2. CONTROL DE CALIDAD

Bacilos gramnegativos:

- Positivo: fermentaciÛn Escherichia coli ATCC

25922. OxidaciÛn Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853

- Negativo: Acinetobacter lwoffii. ATCC 17925

Cocos grampositivos:

- Positivo: fermentaciÛn Staphylococcus aureus

ATCC 25923. OxidaciÛn Micrococcus luteus ATCC

9341.

- Negativo: Medio basal sin carbohidrato.

7. OBTENCI”N Y EXPRESI”N DE LOS

RESULTADOS

Si la vÌa es oxidativa, solamente el tubo si cubrir con

parafina (tubo abierto) vira ligeramente en la parte

superior a amarillo (A), m·s tarde se extender· por

todo el tubo, y nunca con producciÛn de gas.

Si la vÌa es fermentativa hay un viraje intenso a

amarillo que comienza en la parte inferior de los dos

tubos con o sin producciÛn de gas. Se acidifica todo

el medio. SÛlo en la vÌa fermentativa puede

producirse gas, viÈndose el medio con grietas,

burbujas o despegado del fondo.

Un resultado negativo se muestra como color verde

(V)

InterpretaciÛn Tubo

abierto

Tubo

cerrado

SÛlo existe oxidaciÛn

(aerobio estricto)

A V

Existe oxidaciÛn y

fermentaciÛn (anaerobio

facultativo) o puede

fermentar en presencia de

oxÌgeno (aerotolerante)

A A

SÛlo puede utilizar el az˙car

son oxÌgeno (anaerobio

estricto)

V A

8. RESPONSABILIDADES

Personal tÈcnico: realizaciÛn de la tÈcnica, control y

conservaciÛn de las muestras y reactivos.

Personal facultativo: supervisiÛn de la tÈcnica,

resoluciÛn de problemas y consultas. ValidaciÛn de

resultados.

9. ANOTACIONES Y LIMITACIONES DEL

PROCEDIMIENTO

Algunas bacterias no crecen en el medio de HughLeifson.

Puede repetirse la prueba aÒadiendo a cada

tubo 2% de suero o 0,1% de extracto de levadura.

El cambio de color

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