Purificación Y Caracterización De Fosfatasa Alcalina

Purificación y caracterización cinética de la Fosfatasa Alcalina (ALP) de

Escherichia Coli producida en forma recombinante

Resumen:

Se procedió a obtener la enzima a partir de E. Coli recombinante (a la cual se le agregó una etiqueta de polihistidinas), esta nos facilitó aislar la enzima ya que posee una afinidad elevada al sitio de unión en la columna de cromatografía de metal quelado (IMAC). Primero se realizó una lisis celular para obtención de proteínas totales y luego se llevó a cabo la cromatografía antes mencionada.

Luego se realizó un PAGE-SDS (Electroforesis en gel de poliacrilamida) para analizar el grado de pureza del método cromatográfico realizado previamente. Esto se llevó a cabo haciendo el PAGE y luego comparando con patrones de MM conocida para verificar la presencia de cada subunidad de la enzima ya que este gel es desnaturalizante (detergente SDS) lo cual lo divide en sus subunidades.

Se procedió a determinar la actividad enzimática a partir de una lectura espectrofotométrica directa utilizando p-nitrofenilfosfato el cual es incoloro y su hidrólisis produce fosfato y p-nitrofenol (amarillo), así podríamos cuantificar este parámetro. También se hizo la determinación del contenido proteico utilizando el método de Bradford. Luego de esto se calcularon otros parámetros como: actividad enzimática específica, purificación aumentada y rendimiento.

En la última sesión se determinaron los parámetros cinéticos Vm y Km para la enzima y se estudió el efecto inhibitorio del ortofostato a través del cálculo de la Ki.

(1) PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Resultados:

(A) Proceso de purificación

Se procedió a realizar el método de Bradford para comparar los contenidos proteicos de los distintos eluídos y se concluyó que en las fracciones 2 y 3 de nuestra mesada había mejor coloración, por lo tanto en esas habría mayor cantidad de enzima y de otras proteínas que habían quedado luego de la cromatografía. Se guardaron estas fracciones para luego analizarlas por SDS-PAGE en la siguiente sesión.

(B) Electroforesis en geles de poliacrilamida

(C) Determinación de la actividad enzimática

Vol

(ml)

Contenido Proteico (mg/ml)

Actividad enzimática

(U/ml)

CP total

(mg)

Actividad enzimática específica (mg/ml)

Actividad enzimática total

(U)

Recuperación

(%)

Purificación aumentada

(veces)

Extracto

Crudo

2

0.8712

5.82

1.7424

6.68

11.64

100

1

Cromat P.A.

Eluído

1

0.0396

2.13

0.0396

53.79

2.13

18.3

8

Conclusiones y discusión:

Los parámetros obtenidos del extracto crudo en relación a los del eluído son correctos ya que:

El contenido proteico es mayor en el crudo ya que en este hay una mayor cantidad de proteínas mientras que en el eluído prácticamente solo debería haber Fosfatasa alcalina (aunque hayan pasado otras

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